摘要：構建了以大腸桿菌為指示生物的全細胞微生物傳感器，初步探討了其在重金屬（Cu2+， Zn2+， Pb2+）及其二元聯合毒物、農藥污染物（莠滅凈、乙酰甲胺磷）的急性生物毒性分析中的應用性能。結果表明，基于對數生長后期和穩(wěn)定期的大腸桿菌微生物傳感器具有良好的毒性分析性能。最優(yōu)實驗條件為： E.coli培養(yǎng)16 h，苯醌為電子傳遞介體，呼吸基質pH 6～8。所測毒物對E.coli的呼吸抑制作用大小順序為： Cu2+> Zn2+> Pb2+，乙酰甲胺磷>莠滅凈，與發(fā)光細菌、魚類、藻類等其它方法檢測所得結果一致。這種電化學全細胞生物傳感器毒性分析方法具有快速靈敏、成本低廉、操作簡單等優(yōu)點，有望用于水體急性生物毒性的在線監(jiān)測。

關鍵詞：微生物傳感器；大腸桿菌；急性生物毒性；重金屬；農藥

1引言

隨著工農業(yè)生產的迅速發(fā)展，越來越多的有毒物質（如重金屬和農藥）進入水體，對水環(huán)境造成嚴重污染[1]。這些物質在環(huán)境中經過復雜的物理、化學和生物轉化過程，又會形成新的污染物，一些污染物還可能進入食物鏈并在生物體內蓄積，最終對生物產生各種各樣的毒性效應[2]。急性生物毒性實驗可以探明環(huán)境污染物與機體短時間接觸后所引起的損害作用，為環(huán)境污染提供預警[3]。

傳統(tǒng)的理化分析方法可以定量分析某一種或某一類污染物的含量，但不能直接全面地反映各種有毒物質對環(huán)境的綜合影響，無法判定有毒物質濃度和生物效應之間的直接關系[4，5]。除此之外，還需要昂貴的儀器設備，操作程序復雜，并且不能用于水體生物毒性的在線監(jiān)測。利用微生物傳感器對水環(huán)境進行生物毒性檢測的方法，不僅具有成本低、易操作、結果直觀等優(yōu)點，它還可以直接測定水體污染物的急性生物毒性，其測定值能較全面地反映水體中污染物的總毒性效應，具有實際參考價值[6，7]。目前研究和應用最多的是發(fā)光細菌（Luminous bacteria）傳感器，通過光電裝置檢測在毒物作用下發(fā)光菌的光強度變化，評價待測物質的毒性，但這種方法易受樣品色度、濁度和鹽度干擾，檢測前需要對樣品進行預處理[8]。

本工作基于電子傳遞介質的全細胞微生物傳感器毒性分析系統(tǒng)，以大腸桿菌為受試微生物，幾種常見重金屬（Cu2+， Zn2+， Pb2+）、農藥（莠滅凈、乙酰甲胺磷）的單一和混合形式為毒性物質模型，對實際水體的生物毒性進行了初步檢測。其工作原理為：固定于傳感器工作電極表面的微生物呼吸作用產生的電子通過電子傳遞介質在微生物細胞和電極表面之間傳遞，檢測形成的生物電流信號。當毒性污染物存在時，微生物細胞呼吸作用因受到毒性抑制作用，從而表現為電流強度的變化。初步研究表明，這種全細胞微生物傳感器毒性分析法具有不受樣品色度和濁度干擾等特點，并可通過選擇固定特定毒性敏感指示微生物對不同污染物的毒性做出評價，毒性分析結果更客觀真實，檢測范圍寬、靈敏、快速、成本低，適用于大批量化合物和樣品的初篩。此技術的開發(fā)有望用于污染水體的急性生物毒性在線監(jiān)測和快速預警。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

而培養(yǎng)32 h時毒性分析靈敏性明顯下降。由此可見，E.coli 處于對數生長期和穩(wěn)定期時對金屬離子具有良好的毒性敏感性，而處于衰減期時敏感性能下降。其次培養(yǎng)周期為16和24 h時， 制備的微生物傳感器在加入氧化還原介質后， 穩(wěn)態(tài)電流均在400 nA以上；而32 h時， 穩(wěn)態(tài)電流約為100 nA，同時檢測電流的響應曲線平滑度降低，出現數值波動。另外，培養(yǎng)周期為16 h時獲得的E.coli菌體量較高。故實驗選擇E.coli培養(yǎng)周期為16 h。

生物傳感器常需要借助電子傳遞介體加強微生物細胞（或酶）和電極之間的直接電子傳遞，以加快反應速度，降低環(huán)境干擾。常用的電子介體有K3Fe（CN）6、醌類等。本實驗考察了K3Fe（CN）6和p苯醌對傳感器電流信號響應的影響。由圖3B可見，以親脂性的p苯醌為電子傳遞介質時，電流信號響應良好，加入苯醌（0.4 mmolL） 10 s后，電流信號迅速上升，15 min時達到穩(wěn)定狀態(tài)，能很好地滿足后續(xù)生物毒性測定的要求。以0.4～4.0 mmolL K3Fe（CN）6 為電子傳遞介質時，傳感器的電流響應未能有效增強，檢測到的電流增幅均小于苯醌的電流響應。這可能是因為K3Fe（CN）6具有非親脂性，使其難以穿透細胞膜進入細胞質內的氧化還原位點，與文獻[11]的結果一致。Pablo等[12]發(fā)現，K3Fe（CN）6在生物學實驗中可能發(fā)生分解，這意味著K3Fe（CN）6可能對生物催化反應過程造成意想不到的影響，如破壞電子轉移，甚至導致微生物機體的死亡[13]。本實驗選用p苯醌作為電子傳遞介質。

為考察pH值的影響，在加入電子傳遞介質信號穩(wěn)定后，用0.1 molL 的HCl和NaOH調節(jié)呼吸基質pH值。如圖3C所示，pH<5.72時，傳感器的電流信號開始有明顯下降； pH=8.48時，傳感器的電流信號不變化。這表明E.coli的呼吸活性對酸性環(huán)境較為敏感，對堿性環(huán)境具有一定的耐受性。實際生活中E.coli生長的適宜pH=6～8，中性偏堿，偏酸性環(huán)境會有效抑制其生長[14]。所以采用E.coli型微生物傳感器進行毒性分析時，分析底液的pH值應控制在6～8為宜。

3.3對單一及混合重金屬、農藥的急性生物毒性的測定

乙酰甲胺磷是一種低毒型有機磷殺蟲劑；莠滅凈為嗪類除草劑，具有良好的水溶性，可能滲入到地下水中。通過計時電流法分別測定了它們在單一和混合時的急性生物毒性效應。圖3D是純乙酰甲胺磷原藥和純莠滅凈原藥分別在最終濃度為100、50 和25 mgL對大腸桿菌呼吸活動的抑制率。結果表明，乙酰甲胺磷原藥對大腸桿菌的毒性效應比莠滅凈原藥強。同時還檢測了乙酰甲胺磷40%劑型商用農藥，發(fā)現其對大腸桿菌的毒性效應比純乙酰甲胺磷原藥強，這可能是因為乙酰甲胺磷商用農藥里含有苯的緣故。純乙酰甲胺磷和純莠滅凈按1∶1配成混合農藥，檢測其對大腸桿菌的聯合毒性。結果表明，其聯合毒性比單一組分的生物毒性強很多，可能是由于混合組分發(fā)生了相互作用，影響了其在生物體內的分布、吸收，生物轉化、生物利用等[19]，但這種相互作用的具體機制目前仍不清楚。

3.4微生物電極的重復性和穩(wěn)定性

同批次制備的E.coli微生物電極平行測定40 mgL Cu2+ 溶液3次，相對標準偏差為2.3%；將此電極置于4 ℃的冰箱中考察其穩(wěn)定性，每隔7 d測定一次，21 d后仍保留響應電流的70%左右，表明此電極具有較好的重復性和穩(wěn)定性。

3.5對實際水體急性生物毒性的檢測

采用自制的E.coli型微生物傳感器對有機實驗室廢水和河水樣品進行了綜合毒性測定。100 霯待測樣品加入到10 mL呼吸基質中，測得有機實驗室廢水和河水樣品對E.coli呼吸活性的抑制率分別為95.14%和0.62%，故實驗室廢水的綜合毒性很大，河水樣品可視為沒有毒性。

4結論

本研究制備了大腸桿菌全細胞微生物傳感器，并應用于常見重金屬、農藥和實際水體的急性生物毒性的測定，有良好響應。與傳統(tǒng)生物學方法相比，本方法無需對樣品預處理，操作更簡單、快速。下一步實驗將通過固定特定敏感菌株或混合菌種來提高微生物傳感器檢測的靈敏度或廣譜性，以克服如發(fā)光菌等毒性分析方法中存在的菌株選擇的局限性，使毒性反映結果更為真實。