摘要：利用毛細管電泳激光誘導熒光（CELIF）表征了偶聯劑N羥基硫代琥珀酰亞胺 （NHS） 及NHS和1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC） 混合偶聯劑對CdTe量子點活化效果的差異，優(yōu)化了CdTe與轉鐵蛋白（Trf）的偶聯條件，比較了CdTeTrf，CdTeBSA偶聯物及CdTe量子點對Hela細胞的標記效果。結果表明： NHS活化后的量子點性能優(yōu)于混合偶聯劑EDCNHS。31.2 靘olL Trf與CdTe形成的偶聯物CdTeTrf對Hela細胞的標記效果最佳。CdTeTrf在4 ℃孵育20 min可快速標記在Hela細胞的表面；在37 ℃孵育7 h后，可進入Hela細胞內。說明所制得的 CdTeTrf偶聯物具有Trf的生物功能，它可通過特異性識別并結合細胞膜表面的Trf受體而轉入Hela細胞。而CdTeBSA偶聯物的標記不具特異性，CdTe則不能用于Hela細胞的標記。

關鍵詞：毛細管電泳激光誘導熒光 （CELIF）； 量子點； 轉鐵蛋白； 偶聯； 細胞標記

1引言

轉鐵蛋白（Trf）是脊椎動物體中一種非血紅素結合鐵的馇虻鞍祝捎胂赴ど系腡rf受體結合，內吞化形成內吞小體。在特定信號介導下，Trf可以通過釋放鐵離子，轉移出細胞膜外。由于惡性腫瘤細胞過度表達Trf受體，因此，通過標記Trf可進行腫瘤細胞的識別、診斷和治療研究[1，2]。量子點作為一種新型熒光材料，近年來在生物成像研究中快速發(fā)展，特別是在細胞可視化研究方面[3～11]。量子點用于細胞標記一般需將量子點與靶蛋白偶聯，再通過靶蛋白結合在細胞膜或進入胞內顯示量子點的熒光，由此進行靶蛋白在細胞膜及胞內的定位及成像分析。因此靶蛋白與量子點的偶聯體系的構建是量子點生物成像應用的基礎。

本研究選取Trf為靶蛋白，通過其與細胞膜上的Trf受體結合，進而轉運靶蛋白量子點的偶聯物。目前，量子點與蛋白質的偶聯多采用生物素親和素法、共價法及靜電吸附法等。蛋白質與量子點偶聯時，二者的混合比例決定偶聯產物的質量以及生物功能化的效果。在量子點與蛋白質的偶聯反應中建立高效、快速、低成本方法進行表征，對于偶聯體系的優(yōu)化，提高偶聯效率非常必要。本研究利用毛細管電泳激光誘導熒光法（CELIF）的高效、快速、高靈敏和樣品用量少等優(yōu)勢，對Trf與量子點CdTe偶聯的方法和條件進行快速優(yōu)化，并將得到的CdTeTrf偶聯物不經分離而直接用于Hela細胞標記。通過激光共聚焦顯微鏡進行標記效果的成像觀察。實驗結果表明， CdTeTrf偶聯物具有Trf的生物功能，并能特異性識別細胞膜表面的Trf受體，在其介導下可轉運到Hela細胞內，分布在胞質中。CELIF法也適用于其它熒光納米材料的表面功能化效率表征，包括偶聯劑種類的選擇和反應比例的優(yōu)化、偶聯產物的性質表征等，具有一定的通用性。

3結果與討論

采用CELIF進行偶聯條件優(yōu)化可得到偶聯產物的定性與定量信息，如荷電性質、荷質比、熒光強度、穩(wěn)定性等，有助于最佳條件的判斷和選擇。

3.1偶聯劑活化后量子點的表征

因所用量子點是以巰基乙酸為穩(wěn)定劑在水相中合成而得，故量子點表面包覆著一層羧基，而量子點與Trf的偶聯則通過量子點表面的羧基與蛋白質表面的氨基間的酰胺反應完成。NHS和EDC為常用的亞胺偶聯劑，實驗中對比了以NHS及NHS和EDC混合偶聯劑（EDCNHS）活化的量子點性能（圖1）。

由圖1a可見，以單一偶聯劑NHS活化的量子點其熒光強度高且峰形尖銳，說明單一偶聯劑NHS活化的量子點粒徑均一，有利于減少量子點表面缺陷，增強量子點熒光效率。當使用混合偶聯劑活化時，量子點的峰形較寬，峰強度較低（圖1b），說明混合偶聯劑可能導致量子點的穩(wěn)定性降低，量子點間產生一定程度的團聚。導致其峰高降低，峰展寬。對比圖1a和圖1b可見，單一偶聯劑NHS活化后量子點性能好于混合偶聯劑EDCNHS活化的量子點。因此后續(xù)實驗均采用NHS偶聯劑對量子點進行活化[12，14]。

3.2量子點偶聯Trf的條件優(yōu)化

NHS的存在使Trf可有效的偶聯于CdTe表面，形成類似核殼結構的CdTeTrf偶聯產物。由圖2A第一個電泳圖可見，產物峰（3.3 min）相對于活化后的CdTe（圖1a， 6.3 min）遷移時間縮短，即量子點偶聯蛋白后遷移加快，說明Trf確實已偶聯于CdTe表面，且偶聯產物表面電荷性質以及整體的荷質比更接近于蛋白質的遷移時間（約3.0 min）。因此說明不同Trf濃度下形成的偶聯產物均以CdTe為核，以Trf為殼，呈現為核殼復合物。

隨偶聯蛋白Trf濃度的增加，偶聯產物的熒光強度變化如圖2B。當Trf的濃度低于31.2 靘olL時，隨Trf的濃度增加，偶聯產物熒光強度明顯增強。說明包覆于表面的Trf對CdTe表面的晶格缺陷有所改善。Trf的包覆量越多，CdTe表面越完善，熒光強度越高。但當Trf濃度高于31.2 靘olL，熒光強度轉而開始下降。說明偶聯反應在31.2 靘olL時已達飽和，CdTe表面完全被Trf包覆，而溶液中過量的游離Trf不僅對功能化的量子點有一定的熒光猝滅作用，而且在后續(xù)偶聯體系標記細胞時，游離的Trf將與偶聯產物CdTeTrf一起競爭細胞上的Trf受體靶標，嚴重干擾CdTeTrf對細胞表面Trf受體的標記。因此，采用CELIF法對量子點偶聯條件進行優(yōu)化，簡單快速，可明確判斷蛋白質是否偶聯于量子點表面，更有利于嚴格控制Trf與CdTe的反應比例，提高偶聯效率和細胞標記效果，后續(xù)標記時不需要對偶聯體系的產物進行分離純化。由于Trf濃度增高，會使溶液粘度增加，導致電泳峰展寬，因此采用峰面積考察熒光強度變化。

由圖5A可見，當Trf 濃度較低時，偶聯產物CdTeTrf對細胞的標記效率低。這是由于低濃度時，偶聯所得的量子點自身熒光強度較弱（圖2A，低濃度），標記效果欠佳。此外，因量子點表面的Trf較少，與Hela細胞上Trf受體的結合效率較低，導致標記不完全。但當Trf濃度過量時，CdTeTrf量子點標記的效果也較差（圖5C），這主要是由于偶聯體系中存在的過量Trf會與CdTeTrf表面的Trf共同競爭結合Hela細胞中的Trf受體，此時游離的Trf較CdTeTrf粒徑小、位阻小、運動速度快，相比CdTeTrf更易與Trf受體結合，占據了Hela細胞的結合位點，對CdTeTrf與受體位點的結合不利。對比這兩種情況，最優(yōu)條件下制得的CdTeTrf熒光強度高，且體系中不含游離的Trf，不會與細胞表面受體競爭，標記效果最佳（圖5B）。

3.3.3CdTeTrf標記Hela細胞的特異性研究為驗證CdTeTrf對Hela細胞表面Trf受體的結合特異性，分別對裸露的CdTe（圖6A），偶聯了BSA的CdTeBSA（圖6B）及CdTeTrf（圖6C）與Hela細胞的標記進行比較。CdTeTrf的標記效果最佳，而裸露的CdTe和CdTeBSA偶聯物均不能通過與細胞表面的Trf受體結合來標記細胞，故它們結合到細胞表面的速度較含有Trf的CdTeTrf 結合速度慢，進而被內吞進Hela內部的速度也相對較慢。因此在同樣標記時間下，與CdTeTrf共孵育的Hela可吞進更多的量子點，即標記后的熒光強度強。而與Hela共孵育的CdTeBSA通過非特異性結合和內吞作用進入細胞，因此所標記的量子點的量較少，標記效果差； 這一結果同時驗證了偶聯后的CdTeTrf具有的Trf的生物功能，它能特異性識別并與細胞膜表面的Trf受體結合，并在Trf受體介導下被轉運到Hela內部，主要分布在細胞質部分。

以上結果表明，經CELIF方法優(yōu)化得到的CdTeTrf對細胞的標記效果最好， 且CdTeTrf保持了很好的Trf 的生物特性，具有更強的標記功能和選擇性標記能力，可用于存在TrfTrf受體以及其它基于配體受體相互作用的特異性細胞識別。CELIF方法簡單、快速、高靈敏、用量少，能精確控制與熒光納米材料表面進行偶聯所需的功能蛋白質的量。利用此方法得到的偶聯產物可直接用于標記，不需進一步分離純化，可節(jié)省昂貴的靶蛋白的用量。此外，本方法也適用于其它納米材料的表面功能化修飾的表征，具有一定的通用性。