摘要：通過雙槽電化學(xué)腐蝕法制備大面積（12 mm × 58 mm）均勻的多孔硅片，以小鼠免疫球蛋白G（IgG）與兔抗小鼠IgG抗體的相互作用為模型，證明其表面修飾環(huán)氧基團(tuán)后能作為一種基底材料用于蛋白質(zhì)微陣列芯片的構(gòu)建。結(jié)果表明，兔抗小鼠IgG抗體檢測的靈敏度與多孔硅基底制備時所采用的腐蝕電流密度、腐蝕時間、氫氟酸濃度有關(guān)。當(dāng)電流密度為500 mAcm2，腐蝕時間為450 s，HF濃度為25%時，IgG在多孔硅基底上的固定量最大，IgG芯片對兔抗小鼠IgG抗體的檢出限為10 靏L，檢測線性范圍為0.32～10.0 mgL。本方法制備的大面積均勻的多孔硅基底能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片的制作，并具有制備工藝簡單，蛋白質(zhì)固定量大等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：雙槽電化學(xué)腐蝕法；多孔硅基底；蛋白質(zhì)芯片；抗體檢測

1引言

1990年，Canham等[1]報道了多孔硅光致發(fā)光現(xiàn)象以后，多孔硅逐漸為人們所重視，并廣泛應(yīng)用于生物傳感器、藥物運(yùn)輸、光電器件、太陽能電池等領(lǐng)域[2，3]。多孔硅表面的納米結(jié)構(gòu)與腐蝕電流密度、腐蝕時間、HF濃度有關(guān)。

相比于傳統(tǒng)的分析方法，蛋白質(zhì)芯片（Protein microarray）可以實(shí)現(xiàn)成千上萬個樣品的高通量平行分析，具有自動化和微量化等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)芯片通常以功能化的平板玻璃片為基底，應(yīng)用所修飾的官能團(tuán)與蛋白質(zhì)的氨基或羧基等殘基反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固定[4]。相對于二維玻璃基底，多孔硅表面具有三維納米結(jié)構(gòu)，大的比表面積（500 m2g）， 并且多孔硅生物相容性好， 以及表面易修飾不同的官能基團(tuán)（環(huán)氧、醛基、氨基等）而實(shí)現(xiàn)功能化 [5～10]，因此多孔硅能作為一種優(yōu)良的基底材料應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片的制作。目前，已有一些研究組嘗試將多孔硅基底應(yīng)用于生物芯片的制作[2，11]。由于大面積且表面均勻的多孔硅不容易制備，所獲得的多孔硅尺寸通常較小，不利于大規(guī)模微陣列蛋白質(zhì)芯片的制作和數(shù)據(jù)的采集。另外，多孔硅制備條件對蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果的影響尚缺乏系統(tǒng)研究。

本研究采用自制電解池，采用雙槽電化學(xué)腐蝕法[12～15]，制作了大面積均勻的多孔硅基底，并考察了在不同的腐蝕電流密度、腐蝕時間、HF濃度條件下，所獲得的多孔硅基底對小鼠IgG固定效果的影響。成功制作了一種能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建的大面積均勻的多孔硅基底材料。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

晶芯SmartArrayer48微陣列芯片點(diǎn)樣儀和晶芯LuxScan10K微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物技術(shù)有限公司）； CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰化儀器有限公司）； HPC250CL恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）； ZKF035電熱真空干燥箱和101A1ET電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TH2300恒溫培養(yǎng)搖床（北京桑翌科技發(fā)展有限公司）； PHS3BW pH計（上海理達(dá)儀器廠）； 5415R型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；XL30ESEMFEG場發(fā)射掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；IFS66VS傅立葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）。

3結(jié)果與討論

3.1多孔硅基底制備條件的優(yōu)化

3.1.1腐蝕電流密度的影響固定制備多孔硅基底的腐蝕時間為600 s，HF濃度為25%，改變腐蝕電流密度，應(yīng)用自制電解池采用雙槽電化學(xué)腐蝕法獲得了3種腐蝕電流密度（100，300和500 mAcm2）下的多孔硅基底。在表面修飾環(huán)氧基團(tuán)后，制備小鼠IgG芯片與固定濃度（10 mgL）FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體反應(yīng)。結(jié)果表明，腐蝕電流密度為500 mAcm2時，熒光強(qiáng)度最大（圖2），證明該電流密度下小鼠IgG固定量最多。蛋白質(zhì)在多孔硅基底上的固定量隨腐蝕電流密度的增加而增大，這是因?yàn)殡S著腐蝕電流密度的增加，多孔硅表面的孔徑逐漸增大，比表面積隨之增加，從而使蛋白質(zhì)在多孔硅表面的負(fù)載量得到相應(yīng)的提高。但在大腐蝕電流密度（_Symbol～@@_500 mAcm2）作用下，隨著多孔硅孔徑的增大孔壁逐漸變薄，孔狀納米結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度降低，受到溶液表面張力的影響，納米結(jié)構(gòu)發(fā)生龜裂使多孔硅在溶液中的穩(wěn)定性大幅降低，表面發(fā)生坍塌。因此，多孔硅的最佳腐蝕電流密度選擇500 mAcm2。

3.2多孔硅基底的表征

優(yōu)化條件下（腐蝕電流密度500 mAcm2，腐蝕時間450 s，HF濃度25%）所制備多孔硅基底表面的結(jié)構(gòu)如圖5所示。多孔硅表面的納米結(jié)構(gòu)規(guī)整，孔洞分布均勻，排列致密，孔徑分布在15 nm左右?？谞罱Y(jié)構(gòu)增大了多孔硅基底的比表面積，從而提高了蛋白質(zhì)在芯片表面的負(fù)載量，有助于提高芯片檢測的靈敏度。

3.3平板單晶硅環(huán)氧玻璃片多孔硅基底對蛋白質(zhì)固定效果的比較

將2 gL的小鼠IgG固定于3種基底（平板單晶硅，環(huán)氧玻璃片，多孔硅）表面，制作小鼠IgG芯片與等量的FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體反應(yīng)。如圖7所示，多孔硅基底表面的熒光強(qiáng)度是商品化環(huán)氧玻璃片的3.7倍，平板單晶硅的5.3倍。結(jié)果表明，具有較大比表面積的多孔硅基底對蛋白質(zhì)固定效果明顯優(yōu)于平板單晶硅和環(huán)氧玻璃片。在3種基底中多孔硅基底背景最低，且多孔硅基底表面陣列點(diǎn)的直徑介于平板單晶硅和環(huán)氧玻璃片之間，這說明多孔硅基底表面的親疏水性適中，容易獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)陣列。