摘要：以丹皮酚和2，4二羥基苯乙酮為研究對象，采用Q Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，及內(nèi)置有Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑分析的MetWorks代謝物鑒定軟件，系統(tǒng)分析丹皮酚經(jīng)肝微粒體代謝的Ⅰ相代謝及其Ⅰ相代謝產(chǎn)物2，4二羥基苯乙酮經(jīng)微粒體代謝的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，丹皮酚在大鼠肝微粒體中經(jīng)Ⅰ相代謝后產(chǎn)物主要為4位去甲基化的2，4二羥基苯乙酮和1位相鄰羰基的脫甲基化的2羥基4甲氧基苯甲醛以及5位的羥基化代謝產(chǎn)物2，5二羥基4甲氧基苯乙酮，而2，4二羥基苯乙酮的Ⅱ相代謝產(chǎn)物主要為4位葡萄糖醛酸化的糖苷化代謝產(chǎn)物2羥基4′O葡萄糖醛酸苯乙酮。

關(guān)鍵詞：丹皮酚； 2，4二羥基苯乙酮； 大鼠肝微粒體； Q Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)

1引言

隨著藥物代謝研究的不斷深入，具有高分辨率、高靈敏度、高采集速度等特點的質(zhì)譜系統(tǒng)在藥物代謝研究中的應(yīng)用不斷擴展[1，2]，因此越來越多的小分子代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)。由于具有藥理活性的小分子代謝產(chǎn)物在早期ADME（藥物吸收、分布、代謝和排泄）過程中同樣發(fā)揮重要作用，因此受到廣泛關(guān)注。

丹皮酚（Paeonol， Pae），又稱牡丹酚，主要是從蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum （Bunge） Kitagawa干燥根或全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.、芍藥P. lactiflora Pall的根皮中提取分離出來的一種小分子酚類化合物，呈白色針狀結(jié)晶，其分子量為166.17，化學(xué)名稱為2羥基4甲氧基苯乙酮。該活性物質(zhì)具有抗菌、消炎、抗動脈粥樣硬化、增強細(xì)胞免疫等廣泛的藥理活性[3]。研究表明，丹皮酚在體內(nèi)及體外有多種代謝產(chǎn)物，且多為Ⅰ相代謝產(chǎn)物[4，5]，其中最主要的是2，4二羥基苯乙酮（Resacetophenone，Res）[6]。在體內(nèi)它主要是由CYP1A2催化的在丹皮酚4位去甲基的氧化反應(yīng)產(chǎn)物[7]。但是，對于作為重要Ⅰ相代謝中間體的2，4二羥基苯乙酮是否存在Ⅱ相代謝途徑的研究卻鮮有報道。

本實驗采用先進的Q Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)[8]，對丹皮酚經(jīng)鼠肝微粒體P450酶系（CYPs）的Ⅰ相代謝，以及2，4二羥基苯乙酮經(jīng)UGTs的Ⅱ相代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)分析，并根據(jù)一級和二級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)對可能的代謝產(chǎn)物進行鑒定。同時借助MetWorks代謝鑒定軟件內(nèi)置的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑分析功能，對Q Exactive采集的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行進一步分析，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級質(zhì)譜圖相關(guān)性等對可能的代謝物進行定性分析，極大地簡化了數(shù)據(jù)處理流程。通過分析確定了丹皮酚的代謝中間體在體外經(jīng)肝微粒體的Ⅱ相代謝途徑，并發(fā)現(xiàn)了一些新的代謝產(chǎn)物，為丹皮酚體外代謝的進一步研究以及臨床合理化用藥提供新的實驗依據(jù)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Thermo Scientific Q Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，Thermo Accela 600快速液相色譜系統(tǒng)，MetWorks代謝產(chǎn)物軟件分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；R21G型高速冷凍離心機（日本日立公司）；Elix10超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipoer公司）；組織勻漿機（德國IKA公司）；XS105十萬分之一精密電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。2.2大鼠肝微粒體蛋白的來源與處理

清潔級雄性SpragueDawley （SD）大鼠10只，每只體重為（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK（渝）20070002）。斷頭處死后立即取肝臟，用含0.15 mol/L KCl的100 mmol/L（pH 7.4）磷酸鉀緩沖鹽洗至土黃色，冰上勻漿。采用差速離心法制備微粒體[9]，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用 Lowry 法測定微粒體蛋白含量[10]。