摘要：建立了一種置換型熒光偏振免疫分析方法（DFPIA）檢測(cè)水樣中除草劑丁草胺。研究了不同結(jié)構(gòu)示蹤物對(duì)丁草胺DFPIA靈敏度的影響，優(yōu)化篩選出一種熒光示蹤物抗體組成的免疫復(fù)合物；考察了DFPIA置換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。所建立的DFPIA法特異性良好，檢出限為22.6 μg/L，半數(shù)抑制濃度（IC50）為321.3 μg/L，檢測(cè)范圍為60～1472 mg/L，檢測(cè)時(shí)間為12.5 min，添加回收率在88.1%～112.5%間，免疫復(fù)合物可以在4 ℃下穩(wěn)定保存至少1星期以上。本方法適于環(huán)境水樣中丁草胺的篩選檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：熒光偏振免疫分析； 丁草胺

1引言

丁草胺（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）屬于氯乙酰苯胺類除草劑，是一種高效芽前選擇性除草劑，主要用于去除稻田雜草，是我國(guó)生產(chǎn)和使用量最大的除草劑品種之一。丁草胺在環(huán)境中穩(wěn)定性強(qiáng)、殘留期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境和生物有一定的危害性[1]。目前，對(duì)除草劑的檢測(cè)主要是以氣相色譜或液相色譜為基礎(chǔ)的方法[2，3]。盡管儀器分析法準(zhǔn)確可靠，但前處理操作繁瑣，需較高技能的專業(yè)人員操作，成本較高。近年來(lái)，快速、簡(jiǎn)便的免疫分析方法在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)之一[4]。

熒光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）作為一種均相免疫分析方法，無(wú)需分離洗滌步驟，反應(yīng)時(shí)間基本上取決于分析試劑加入的時(shí)間，為高通量、自動(dòng)化免疫分析的實(shí)現(xiàn)展示了良好的應(yīng)用前景[5，6]。 但目前在食品、環(huán)境污染物分析領(lǐng)域中研究應(yīng)用很少[6～10]。本研究組曾建立了一種基于競(jìng)爭(zhēng)原理的丁草胺熒光偏振免疫分析方法[8]，使用時(shí)先加入分析物和示蹤物，然后加入抗體，標(biāo)記抗原和分析物開(kāi)始競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，平衡后進(jìn)行檢測(cè)。本研究采用基于置換原理的單試劑熒光偏振免疫分析方法（Displacement FPIA，DFPIA）檢測(cè)丁草胺，預(yù)先將抗體和熒光示蹤物混合制備出免疫復(fù)合物貯存待用，使用時(shí)只需將分析物加入，經(jīng)短時(shí)間反應(yīng)，測(cè)定熒光偏振信號(hào)?？疾炝私Y(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、置換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、方法特異性、穩(wěn)定性、添加回收率等，建立了一種丁草胺DFPIA分析方法。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Wallac VICTOR3 1420多標(biāo)記分析儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）；U3010 紫外可見(jiàn)光譜掃描儀（日本Hitachi公司）；熒光微孔板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司）。丁草胺（分析純，山東濱州農(nóng)藥公司）；牛血清的蛋白（BSA）、異硫氰酸熒光素異構(gòu)體Ⅰ（FITC isomer Ⅰ）、5氨基熒光素（AF）、N，N′二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、乙二胺、己二胺（Sigma 公司）；其它試劑均為市售分析純；硼酸緩沖液（BB溶液，50 mmol/L，pH 8.0）作為稀釋液用于所有樣品稀釋。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1熒光示蹤物制備

丁草胺半抗原BMPA、不同長(zhǎng)度手臂的熒光示蹤物BMPAAF、BMPAEDF和BMPAHDF（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），按照文獻(xiàn)[8]的方法制備。