摘要：建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCMS/MS）檢測酶促反應(yīng)體系中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）濃度變化，快速篩選3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）抑制劑的方法。優(yōu)化了HMGCR酶促反應(yīng)體系和檢測NADPH的色譜質(zhì)譜條件，探討了NADPH的離子化試劑的作用和質(zhì)譜碎裂機(jī)理。采用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以三乙胺/六氟異丙醇緩沖液（pH=8.0）為流動相，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測模式，對酶促反應(yīng)體系中的NADPH進(jìn)行分析。NADPH的峰面積與其濃度在0.05～50 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r>0.9996），定量限（S/N=10）為0.05 μmol/L。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶； 抑制劑篩選

體內(nèi)過多的膽固醇會引起血脂偏高，進(jìn)而誘發(fā)冠心病、心肌梗塞等心血管疾病，因此HMGCR成為治療此類疾病的主要靶標(biāo)酶[2]。目前，臨床治療高膽固醇癥的藥物主要為他汀類藥物（如普伐他汀），該類藥能夠競爭性的抑制HMGCR的活性，從而達(dá)到降低膽固醇的合成速率，降低血脂的目的，但其副作用近年來也屢見報(bào)道[3，4]。因此開發(fā)新型的副作用小、效果明顯的HMGCR抑制劑，特別是從天然產(chǎn)物中篩選其抑制劑，已成為當(dāng)今降血脂藥物研發(fā)的一大熱點(diǎn)。

以往體外篩選HMGCR抑制劑，主要利用分光光度法[5]和HPLC法[6]，通過檢測上述反應(yīng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）的量的改變來評價(jià)HMGCR的活性變化。然而由于NADPH極性太大，在C18色譜柱里幾乎沒有保留，且很多天然產(chǎn)物都有很強(qiáng)的紫外吸收，因此HPLC法無法將NADPH與抑制劑等酶促反應(yīng)體系中其它物質(zhì)分開，在篩選HMGCR抑制劑的時(shí)候容易造成數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。本研究利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCMS/MS）檢測酶促反應(yīng)體系中NADPH濃度變化，快速篩選HMGCR抑制劑的方法。該方法通過引入離子化試劑三乙胺/六氟異丙醇（TEA/HFIP），顯著增強(qiáng)了NADPH的質(zhì)譜信號。相比紫外檢測器有更強(qiáng)的信號，使得NADPH可以用質(zhì)譜確證分析檢測，相比HPLC法更為準(zhǔn)確，特別適用于復(fù)雜天然產(chǎn)物中HMGCR抑制劑的篩選。同時(shí)對色譜分離中的色譜柱和流動相對分離效果的影響進(jìn)行了探討，優(yōu)化了HMGCR酶促反應(yīng)體系。利用本方法對綠茶、普洱茶和紅茶對HMGCR的抑制效果進(jìn)行了比較。