孫正祥，王 豐，黃 玲，周 燚

(長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

西瓜枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp niveum FON)引起的維管束土傳病害，是西瓜產(chǎn)業(yè)中最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，一般發(fā)病率為10% ～30%，嚴(yán)重的達(dá)80% ～90%，重茬地甚至造成絕產(chǎn)［1］。病原菌從土壤根系侵入，引起維管束變褐壞死，導(dǎo)致瓜秧枯死，其厚垣孢子在土壤中可存活十年之久，嚴(yán)重影響西瓜的種植［2］。目前，對該病害尚無有效的防治方法，傳統(tǒng)的輪作雖在一定程度上能減輕病害發(fā)生，但隨著市場對西瓜需求量的增長，西瓜種植面積逐年擴(kuò)大，輪作防病措施難以實施［3］。研究表明，在植物體內(nèi)存在大量的益生菌，已在多種植物體內(nèi)分離篩選到防病效果明顯的內(nèi)生細(xì)菌［4］。有些內(nèi)生細(xì)菌還具有促生、固氮等生物功能，是植物病害防治的重要資源，尤其對化學(xué)藥劑難以控制的土傳病害、維管束病害及系統(tǒng)性病害發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢［5］。筆者從湖北荊州西瓜枯萎病病區(qū)采集的健康西瓜樣品，通過平板對峙及抑菌圈雙重法篩選到一株對西瓜枯萎病菌有強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌XG－1，研究其抑菌范圍及對西瓜枯萎病菌菌絲及孢子萌發(fā)的抑制作用，根據(jù)形態(tài)特征和16S rDNA序列對其鑒定，旨在為西瓜枯萎病的防治提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum Schw.)，均由長江大學(xué)植物病理學(xué)研究室提供。

NA培養(yǎng)基:依次準(zhǔn)確地稱取牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g放入少量水?dāng)嚢杓訜崾怪刍?，定容?000mL，加入瓊脂粉20 g，繼續(xù)攪拌加熱使之熔化。使用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至 7.0 －7.2，分裝，滅菌。

PDA培養(yǎng)基:稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成條狀，加適量水煮沸20min，紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂，定容至1000mL，煮沸后分裝，滅菌。

Waksman培養(yǎng)基:依次準(zhǔn)確地稱取蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏3 g，NaCl 5 g，放入少量水?dāng)嚢杓訜崾怪刍?，定容?000mL，加入瓊脂粉20 g，繼續(xù)攪拌加熱使之熔化。使用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié) pH至6.8，分裝，滅菌。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離

運(yùn)用組織研磨法［6］，采集病區(qū)健康的西瓜植株樣品，用蒸餾水將表面沖洗干凈，用滅菌濾紙吸干水分。用無菌刀將植株根的表皮切去，切成1.0～2.0 cm小段，在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒液中浸泡30 s，1 g/L升汞液中消毒3min，無菌蒸餾水漂洗4次，最后一次洗滌液涂布平板做空白對照。將樣品置于滅菌的研缽中研磨，加適量無菌水研磨至勻漿狀。取1mL液體梯度稀釋成10－1－10－7，分別取10－5、10－6、10－7梯度下的50μL稀釋液涂布于NA平板，重復(fù)3次，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。2 d后，挑取形態(tài)、大小和顏色等特征不同的菌落重新于NA平板上劃線純化，最后移入斜面試管于4℃冰箱中保存，備用。若對照處理的平板上無菌落出現(xiàn)，表明植株材料表面消毒徹底，分離到的為內(nèi)生細(xì)菌。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

1.3.1 初篩 采用平板對峙法［7］，將PDA平板上活化的西瓜枯萎病菌用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，置于Waksman平板中央，在距其2 cm處呈三點(diǎn)對稱接入內(nèi)生細(xì)菌，以只接入枯萎病菌的處理為對照。置于28℃培養(yǎng)，待對照長滿全皿時，測量抑菌帶大小。挑取對靶標(biāo)病原菌有明顯抑制作用的菌株，純化后保存，備用。

1.3.2 復(fù)篩 (1)西瓜枯萎病菌孢子懸浮液的制備。將西瓜枯萎病菌接種于PDA平板，25℃倒置培養(yǎng)5 d。挑取經(jīng)平板活化的病原菌菌絲塊于PDA培養(yǎng)液，25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)一周，備用，顯微鏡下觀察產(chǎn)孢情況。

(2)供試菌株無菌濾液的制備。用接種環(huán)蘸取初篩的菌株接入盛有100mL NA培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，28℃，160 r/min培養(yǎng)2 d，得到拮抗菌懸浮液。取適量菌懸浮液，8000 r/min離心10min，上清液經(jīng)微孔濾膜(Ф=0.22 μm)過濾，即為無菌濾液。

采用抑菌圈法［8］，在滅菌的培養(yǎng)皿中倒入10mL PDA培養(yǎng)基，待冷卻后將牛津杯左右對稱置于平板上，再將混有病原菌孢子懸浮液的Waksman培養(yǎng)基緩緩倒入培養(yǎng)基中，冷卻。在左側(cè)牛津杯中滴加200μL拮抗菌無菌濾液，右側(cè)牛津杯中滴加NA培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)，待菌絲長滿全皿時，測量抑菌圈大小。

1.4 拮抗菌株XG-1的抑菌譜測定

同樣采用平板對峙法，測定拮抗菌株對棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、棉花立枯病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌的抑菌活性。

1.5 拮抗菌株XG-1的鑒定

1.5.1 形態(tài)特征 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］，按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

1.5.216 S rDNA序列分析 模板:菌株XG－1基因組DNA。引物為通用引物:16(+):5＇－AGAGTT TGA TCA TGG CTC AG －3';16(－):5'－TAG GGT TAC CTT ACG ACT T －3'。PCR 擴(kuò)增體系(20μL):模板DNA 1.5μL，引物(0.05 mol/L)各1μL，TaqTM1.5μL，Mg2+(25mmol/L)2μL，10 ×Buffer 2μL，dNTP(10mmol/μL)0.5μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10min;94℃ 變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物采用TIANGEN的DNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段，測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。應(yīng)用BLAST軟件進(jìn)行序列分析，并與GenBank中已知的16S rDNA進(jìn)行同源性分析。

1.6 拮抗菌XG-1對病原菌菌絲生長的影響

進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中，在西瓜枯萎病菌菌落和拮抗菌菌落之間放置滅菌的蓋玻片，培養(yǎng)5 d，待菌絲爬上后，取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

1.7 拮抗菌XG-1對病原孢子萌發(fā)的影響

以凹玻片法進(jìn)行測定［10］，用無菌水配制濃度約為1.0×105個/mL的西瓜枯萎病菌孢子懸浮液，吸取20μL加入凹玻片中，分別按體積比1∶1混入100%、60%、40%和20%的菌株XG－1無菌濾液，使得無菌濾液終濃度為50%、30%、20%和10%，置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃下培養(yǎng)，12 h后光學(xué)顯微鏡下鏡檢其孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每處理檢測100個孢子，設(shè)3次重復(fù)。以NA液體培養(yǎng)基代替無菌濾液為對照，計算孢子萌發(fā)率和萌發(fā)抑制率，公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

從湖北荊州地區(qū)采集的西瓜樣品分離得到細(xì)菌97株，初篩得到具有拮抗效果的細(xì)菌6株(表1)。其中菌株XG－1抑菌帶最大，達(dá)26.2mm(圖1)，能有效抑制西瓜枯萎病菌的生長。對菌株HL－2等6株菌株復(fù)篩結(jié)果表明，菌株XG－1的抑菌圈直徑(21.4mm)仍為最大(圖2)。

2.2 拮抗菌XG-1的抑菌譜測定

平板對峙培養(yǎng)結(jié)果表明，菌株XG－1具有較為寬廣的抑菌譜，與所有供試的病原真菌對峙培養(yǎng)7 d后，均能產(chǎn)生明顯的抑菌帶，如表2所示。其中，對棉花枯萎病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬達(dá)23.1mm。

HL －2 15.2 HL －5 14.3 WF －1 16.0 WF －4 17.1 XG －1 26.2 XG －4 15.6

圖1 菌株XG－1與西瓜枯萎病菌(FON)的對峙培養(yǎng)Fig.1 Confrontation culture of strain XG －1 and FON

圖2 菌株XG－1對西瓜枯萎病菌(FON)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of strain XG －1 on FON

表2 菌株XG-1抑菌譜的測定Tab.2 Test of strain XG-1 antibacterial spectrum

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定 菌株XG－1在NA培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面粗糙，不透明，污白色。圓形或不規(guī)則形，邊緣不光滑，隨時間培養(yǎng)的延長，菌落邊緣呈鋸齒狀，表面干燥皺縮。革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀，有芽孢。初步將菌株XG－1鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.3.2 分子鑒定提取菌株XG－1基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明在1500 bp左右有一條明顯的條帶。切膠回收后交上海博亞公司測序，在 GenBank中的登錄號為KC348439，進(jìn)行 Blast同源序列比對，與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似性達(dá)99%，結(jié)合菌株XG－1形態(tài)特征，將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

圖3 拮抗菌XG－1對西瓜枯萎病菌(FON)菌絲生長的影響Fig.3 Effect of antagonistic strain XG －1 on FON mycelia growth

2.4 拮抗菌XG-1對病原菌菌絲生長的影響

將菌株XG－1與西瓜枯萎病菌對峙培養(yǎng)5 d后，靠近接抗菌的病菌不能正常擴(kuò)展生長，取出蓋玻片顯微觀察。結(jié)果圖3所示，對照菌絲表面光滑，生長茂盛，而對峙培養(yǎng)的菌絲稀疏，原生質(zhì)濃縮，出現(xiàn)空泡，部分發(fā)生斷裂，膨大。

2.5 拮抗菌XG-1無菌濾液對病原菌孢子萌發(fā)的影響

XG－1無菌濾液與西瓜枯萎病菌孢子懸浮液按不同濃度共培養(yǎng)12 h后，鏡檢結(jié)果如圖4所示，從中可看出，XG－1無菌濾液對西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度的增加而增加，當(dāng)無菌濾液濃度為50%時，抑制率達(dá)到72.89%，當(dāng)濃度為10%時，抑制率僅為15.51%。

圖4 菌株XG－1無菌濾液對西瓜枯萎病菌(FON)孢子萌發(fā)的抑制Fig.4 Inhibition of cell－free filtrate of strain XG －1 on the germination of FON spores

3 結(jié)論與討論

隨著人們對環(huán)境及健康意識的提高，人們對植物病害的防治觀念逐漸由傳統(tǒng)的化學(xué)防治轉(zhuǎn)變到生物防治［11］。目前，用于西瓜枯萎病的生防菌主要集中在叢枝菌根(AM)真菌及根際土壤微生物［12－14］，有關(guān)利用植物內(nèi)生菌進(jìn)行西瓜枯萎病防治的研究報道不多。研究表明，在植物體內(nèi)存在著大量的對植物病害具有較好防治作用的內(nèi)生菌，這些內(nèi)生菌對化學(xué)藥劑難以發(fā)揮作用的植物土傳病害、維管束病害更顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢［15］。宋光桃［16］從健康油茶組織中分離篩選出枯草芽孢桿菌R6，對油茶根腐病菌的抑菌圈半徑達(dá)12mm。本研究通過平板對峙及抑菌圈法雙重法，從西瓜植株內(nèi)分離篩選到一株對西瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌XG－1，抑菌圈直徑達(dá)21.4mm，并將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

芽孢桿菌由于自身的眾多優(yōu)勢，廣泛存在于自然界，生長快、營養(yǎng)簡單、易分離培養(yǎng)，其開發(fā)與應(yīng)用是一直是生物防治的熱點(diǎn)。本試驗中，枯草芽孢桿菌XG－1對西瓜枯萎病菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用，使其變得稀疏，出現(xiàn)畸形特征，還能抑制病原孢子的萌發(fā)，這與LIU［17］等的研究報道相符。

近年來，植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌活性物質(zhì)的研究較多，認(rèn)為其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要包括細(xì)菌素、活性蛋白及脂肽類、多肽類等［18］。江木蘭［19］從油菜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BY－2的胞外抑菌物中分離純化出枯草菌表面活性素Surfactin。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株XG－1的無菌濾液能形成明顯的抑菌圈，表明其胞外產(chǎn)生了活性物質(zhì)，具體類型及性質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

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