王 荻，劉紅柏

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院/黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 15007)

中草藥具有天然、高效、毒副作用少、資源豐富、價格低廉等特點，同時兼有藥用和營養(yǎng)的雙重作用，既可調(diào)節(jié)動物的健康狀況，提高水產(chǎn)動物性能和飼料利用率，又可改善機體的免疫機能，防治水產(chǎn)動物病害，是其他禁用抗菌素和化學(xué)藥物的替代產(chǎn)品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中越來越受到人們的青睞［1］。

目前中草藥作為免疫調(diào)節(jié)劑已逐步應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，關(guān)于牙鲆［2］、鏡鯉［3］、黃顙魚［4］、異育銀鯽［5］等各種水產(chǎn)動物應(yīng)用效果的報道越來越多，但是關(guān)于鱘魚方面的報道仍較少［6－8］，還需進行大量工作篩選適合于鱘魚的中草藥免疫調(diào)節(jié)劑。

隨著我國鱘魚人工繁殖、人工養(yǎng)殖技術(shù)的不斷完善、推廣，這種大型珍貴魚類的養(yǎng)殖范圍逐漸擴大，產(chǎn)量逐年遞增，其產(chǎn)量及利潤在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中所占比例日漸升高。因其獨特的外貌體征，鮮嫩的肉質(zhì)及豐富的營養(yǎng)含量，作為一種名特優(yōu)魚種，鱘魚越來越受到高等餐桌的接納和歡迎，在兼具生態(tài)價值、觀賞價值的同時也具有極高的經(jīng)濟價值。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；l(fā)展，健康綠色養(yǎng)殖已成為現(xiàn)代漁業(yè)的必然發(fā)展方向，中草藥作為一種綠色、健康、營養(yǎng)的免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于水產(chǎn)動物病害防治已成為目前水產(chǎn)行業(yè)研究的熱點。而目前國內(nèi)關(guān)于鱘魚用中草藥添加劑的研究仍較少，且未見對運輸、養(yǎng)殖過程中遇到的高溫應(yīng)激的調(diào)節(jié)方面研究的報道。本實驗選取一種單方和兩種復(fù)方，研究他們對施氏鱘常溫及熱刺激下特異性免疫功能的影響，為中草藥在鱘魚這一極具潛力的養(yǎng)殖品種的應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康非免疫狀態(tài)下1+齡施氏鱘(Acipenser schrenckii)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心提供，平均體質(zhì)量為 0.08 ～0.10 kg。

實驗用中藥均購自哈藥集團世一堂藥店，烘干粉碎后備用;溶菌酶測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

白細胞吞噬實驗采用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)，所用菌株為實驗室鑒定保存菌株。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥方劑及藥液的制備 實驗共選用一種單方及兩種復(fù)方，單方為貫眾，自組復(fù)方一由黃芪、黨參、防風(fēng)、柴胡等組成，復(fù)方二由當歸、黃芪等組成。

各方劑按其配比稱取中藥，放入砂鍋中，加水浸泡30min，第一次熬45min，將藥汁倒出，再加水熬30min，過濾，將兩次藥汁合并濃縮成100mL，其中1mL藥液相當于1 g中藥方劑(干物質(zhì))的水煎劑，經(jīng)高壓滅菌后存放于冰箱(4℃)中備用。

1.2.2 實驗魚的飼養(yǎng)及樣品采集 隨機選取施氏鱘于室內(nèi)水族箱(0.90 m×0.50 m×0.45 m)水溫22℃下預(yù)飼兩周，每組兩個平行，各15尾魚，保持各水族箱養(yǎng)殖條件均一，每天按魚體質(zhì)量的2.0%投喂全價基礎(chǔ)飼料。

預(yù)飼結(jié)束后，按照貫眾每50 kg體質(zhì)量給藥劑量為9 g，方一為175 g，方二為36 g，口灌連續(xù)給藥兩周。給藥結(jié)束后，將半數(shù)魚放入30℃的控溫水族箱中熱刺激2 h，然后與在正常水溫22℃下的實驗魚一同取樣。自實驗魚尾動(靜)脈采血，低溫靜置后離心分離血清，并解剖取魚鰓、肝、幽門毛囊、胃、腸等各組織樣品，立即于－80℃下保存。

1.3 各項指標的測定

1.3.1 樣品的處理 準確稱取實驗魚組織樣品與預(yù)冷的生理鹽水按1∶9稀釋，勻漿機充分勻漿，分別按不同檢測指標及試劑盒所要求的速度和時間離心，取上清液進行檢測。血清在37℃下水浴融化后即可檢測。每個監(jiān)測指標的樣本數(shù)n=15，均設(shè)平行樣。

1.3.2 生化指標的檢測 采用Beckman公司生產(chǎn)的CYNCHRON CH4PRO全自動生化分析儀進行檢測。檢測指標包括:總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比例。

1.3.3 白細胞吞噬 復(fù)蘇保存的嗜水氣單胞菌菌株，37℃基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基搖菌18 h，將菌液水浴煮沸10min。參照王樹芹等的方法［9］測定白細胞吞噬，采用公式如下:

1.3.4 溶茵酶含量的測定 施氏鱘血清及各組織溶菌酶測定方法參照劉紅柏等［10］，溶菌酶的含量計算公式如下:

其中:Tt——水浴后吸光度At換算出的透光度;T0——水浴前吸光度A0換算出的透光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 各項酶活性值數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS軟件最小顯著差數(shù)法(LSD)進行處理;生化指標采用SPSS統(tǒng)計軟件中的單因子方差分析進行統(tǒng)計，鄧肯氏法進行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 施氏鱘血清中蛋白含量及白球比例的變化

對照組及實驗組施氏鱘血清中總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLU)含量及白球比例(A:G)具體變化情況見表1。表中用高溫標記熱刺激組，下同。

表1 施氏鱘血清中TP、ALB、GLU含量及A:G比值的變化Tab.1 Content of TP，ALB，GLU and value of A:G in blood plasma of Amur sturgeon

由表2可見，TP和GLU最高值均出現(xiàn)在常溫貫眾組，而ALB及A∶G的最高值分別出現(xiàn)在高溫貫眾組和常溫方一組。且4個組別之間TP和ALB均無顯著性差異，而常溫方一組的GLU含量顯著低于常溫貫眾組，常溫貫眾組的A∶G比值顯著低于常溫方一組和常溫對照組。且3種血清蛋白的最小值均出現(xiàn)在常溫方一組。

2.2 施氏鱘白細胞吞噬功能的變化

對照組及實驗組施氏鱘白細胞吞噬率PP見圖1。由圖1可見，PP的最大值和最小值分別出現(xiàn)在高溫方一組和高溫方二組，且對照及方一均表現(xiàn)為熱刺激后PP升高，而方二和貫眾組則降低。且方一和方二PP值受熱刺激影響較大，但只有高溫方一組顯著高于其他所有組別(P＜0.05)，其余各組均未呈現(xiàn)顯著性變化。

白細胞吞噬的細菌個數(shù)及吞噬指數(shù)PI見表2。由表2數(shù)據(jù)可見，各實驗組吞噬細菌個數(shù)差別較大，吞噬最大值出現(xiàn)在高溫貫眾組為80個左右，而最小值高溫方二組為49個左右。高溫貫眾組的吞噬指數(shù)顯著高于方一組合常溫貫眾組。

圖1 白細胞吞噬率變化Fig.1 Variety of neutrophil phagocytic rate

2.3 施氏鱘各組織中溶菌酶活性變化

對照組及各實驗組常溫下血清、肝、幽門毛囊、胃、腸、鰓組織中溶菌酶活性變化情況如圖2所示，而熱刺激后的變化見圖3。

由圖2可見，常溫養(yǎng)殖條件下，各組織中溶菌酶活性差別較大，但是各實驗組測定結(jié)果呈現(xiàn)較一致的變化趨勢，均為腸及幽門毛囊組織中酶活性較高，而血清、胃和鰓組織中活性較低。在平均酶活性最高值出現(xiàn)在腸組織中，為 5.21 μg/g，各組別在該組織中酶活性大小為:方一組＞貫眾組＞對照組＞方二組，且方一組顯著高于對照組，極顯著高于方二組。且除了方一組中幽門毛囊組織外，方一及貫眾實驗組各組織的酶活性均高于對照組，方一鰓組織中酶活性更是顯著高于其他三組，而方二組各組織中酶活性都偏低。

由圖3可見，高溫刺激后，各組織內(nèi)酶活性的總體分布趨勢不變，但腸組織內(nèi)酶活性普遍降低，但酶活性大小依然為:方一組＞貫眾組＞對照組＞方二組，最大值為5.89 μg/g。與常溫相應(yīng)實驗組相比，方一組肝組織中酶活性顯著提高，鰓組織中極顯著提高。且高溫方一組血清及肝臟中酶活性均顯著(P＜0.05)高于其他3個高溫刺激實驗組。

表2 中藥方劑對施氏鱘白細胞吞噬作用的影響Tab.2 Effect of leukocytic phagocytosis in Amur sturgeon

圖2 常溫下溶菌酶活性變化Fig.2 Variety of lysozyme activity under usual temperature

圖3 熱刺激后溶菌酶活性變化Fig.3 Variety of lysozyme activity after heat stress

3 討論

選用單方貫眾，及自組復(fù)方方一和方二，通過對施氏鱘口灌給藥14 d后，對魚體內(nèi)各組織中免疫相關(guān)活性物質(zhì)及酶活性的測定結(jié)果表明，中藥方劑對施氏鱘非特異性免疫功能有一定的影響，且在高溫刺激下表現(xiàn)出一定的應(yīng)答反應(yīng)。

3.1 中藥方劑對施氏鱘血液中蛋白含量的影響

魚類血液指標被廣泛用來評價魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應(yīng)狀況的生理、病理和毒理學(xué)指標［10］。有報道指出，一些活性多糖能提高魚類飼料利用率及其機體血糖水平，相應(yīng)的加速了對葡萄糖的蛋白合成，細胞分泌到血液中的蛋白量增加，代謝旺盛，致使血清中總蛋白含量也增加，增強蛋白質(zhì)合成代謝，提高魚體增重率和特定生長率，從而促進魚體生長［11－13］。實驗結(jié)果表明，選用方劑貫眾及方二均有效提高了施氏鱘血漿中總蛋白含量，而方一常溫組隨略低于對照組，但是高溫刺激組有顯著提升，這樣的結(jié)果與以上研究結(jié)論一致。

而血清中球蛋白含量在一定程度上對機體的免疫狀態(tài)有所影響［14］，其含有的γ－球蛋白，對機體免疫具有促進作用。實驗中，除常溫方一組外，其余各組球蛋白含量均高于對照組，且常溫貫眾組顯著高于常溫方一組。這樣的結(jié)果表明，中藥方劑對施氏鱘血清中免疫相關(guān)活性物質(zhì)有促進作用。

綜上，貫眾及方二口灌給藥14 d，能有效提高施氏鱘血清中總蛋白、白蛋白及球蛋白含量，有利于提高魚體非特異性免疫能力及促進魚體快速生長。而方一在常溫養(yǎng)殖下無顯著作用，但是在應(yīng)答高溫刺激時，對魚體血清中蛋白含量的提升有顯著的促進作用。

3.2 中藥方劑對施氏鱘白細胞吞噬能力的影響

動物體內(nèi)的吞噬細胞可以吞噬進入體內(nèi)的異物，吞噬細胞在消化病原生物的同時可保留有關(guān)抗原信息并將其傳遞給相關(guān)的淋巴細胞，從而激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫。因此，吞噬細胞的吞噬活性直接與動物的免疫機能有關(guān)。魚類白細胞對病原菌的吞噬和殺菌作用也是魚類非特異性免疫的一個重要方面［15］。

已有研究證實，在飼料中添加適量的免疫增強劑［16］或免疫多糖［17］能增強魚類非特異性免疫功能，有效提高其白細胞吞噬活性。而貫眾及方二給藥常溫組白細胞吞噬率略高于對照組，而高溫刺激后則略低于對照組，但并未形成顯著性差異。而方一常溫組略低于對照組，但高溫刺激后顯著高于所有組別。這樣的實驗結(jié)果表明，本文所選用的單方貫眾及兩個復(fù)方對施氏鱘白細胞吞噬功能均無顯著提升，但方一能促進機體在熱刺激情況下做出有益、高效的應(yīng)答反應(yīng)。

3.3 中藥方劑對施氏鱘各組織中溶菌酶活性的影響

溶菌酶也是魚類抵抗并與菌感染的重要因素［18］，它的量和活性變化是由于免疫物質(zhì)刺激巨噬細胞分化導(dǎo)致溶菌酶基因復(fù)制來進行的［19］。

本實驗結(jié)果表明腸及幽門毛囊內(nèi)溶菌酶活性較高，而血清和鰓組織內(nèi)較低，與報道的虹鱒添加免疫調(diào)節(jié)劑在局部消化道內(nèi)的免疫反應(yīng)比系統(tǒng)免疫反應(yīng)變化大［20］相一致。而在中藥方劑的作用下，雖然大部分組織中溶菌酶活性略高于相應(yīng)的對照組，但基本未形成顯著性差異，與白細胞的小浮動變化相似，這樣的結(jié)果符合已報道的溶菌酶的活性變化與循環(huán)系統(tǒng)中白細胞數(shù)目變化相一致［21］。且值得注意的是，方一給藥的實驗組在熱刺激后各組織中溶菌酶活性下降較少，表現(xiàn)出較強的應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，實驗選取的中藥方劑對施氏鱘血清中蛋白含量，白細胞吞噬能力及各組織中溶菌酶活性均有一定的提高和促進作用。貫眾及方二對于魚血清中各種蛋白含量提高及白細胞吞噬活性有較好的促進和增強作用，而方一在促進魚體對高溫刺激做出高效應(yīng)答、提高魚體應(yīng)急情況下的免疫調(diào)節(jié)有較好的作用。

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