任 濤 ，李多偉 ，閆 釗 ，侯瑩瑩 ，劉長(zhǎng)霞

（1.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710068；2.陜西三原紅旗實(shí)業(yè)有限公司，陜西 咸陽 713800；3.陜西略陽縣華瑞杜仲開發(fā)有限責(zé)任公司，陜西 略陽 724300）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.為杜仲科杜仲屬植物[1]。在杜仲果實(shí)、樹皮和葉中均含有豐富的杜仲膠。我國(guó)杜仲樹的種植面積約70萬hm2以上，每年有大量可利用的，可形成一種新的天然橡膠的再生資源——杜仲葉資源。杜仲膠是從杜仲樹等植物中提取出來的，其主要成份是反式-1,4-聚異戊二烯（簡(jiǎn)稱TPI）。TPI本身具有很多獨(dú)特的個(gè)性，室溫下是有固定形態(tài)的硬塑料，60 ℃以上成為可產(chǎn)生各種形變的橡膠，是一種優(yōu)秀的形狀記憶性功能材料；當(dāng)交聯(lián)度達(dá)到一定程度時(shí)，它又成為完全的橡膠彈性體，可以用來制作輪胎和各種橡膠制品。所以杜仲膠在醫(yī)用材料、橡膠制品等領(lǐng)域應(yīng)用前景十分廣闊[2-4]。杜仲膠工業(yè)生產(chǎn)的提取方法有堿液浸提法、溶劑法等[5-8]，這些方法大多直接采用杜仲果實(shí)、樹皮和杜仲葉，原料成本高、溶劑消耗量大、提取率低，尤其是生產(chǎn)成本偏高，致使杜仲膠得不到有效地推廣和應(yīng)用。本試驗(yàn)中采用提取杜仲粉或綠原酸后自然風(fēng)干的杜仲葉殘?jiān)鳛樵希美w維素復(fù)合酶將細(xì)胞壁中的纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)酶解為低聚糖和單糖，細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)被破壞，使杜仲葉殘?jiān)卸胖倌z絲易與葉片其它部分脫離，從利用杜仲葉殘?jiān)?、降低提取用溶劑量以及減少提取用時(shí)等諸多方面來達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的[9-11]。筆者用蒽酮-硫酸法測(cè)定酶解液中總糖的含量[12]，以總糖含量和杜仲膠提取率為考察指標(biāo)，著重研究纖維素復(fù)合酶預(yù)處理杜仲葉殘?jiān)崛《胖倌z的生產(chǎn)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉殘?jiān)申兾髀躁柨h華瑞杜仲開發(fā)有限責(zé)任公司提供，纖維素酶復(fù)合酶購(gòu)于杰諾生物酶有限公司，葡萄糖對(duì)照品購(gòu)于西安化學(xué)試劑玻璃儀器采購(gòu)站，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.825 0 g，用蒸餾水溶解并定容至250 mL，搖勻。

蒽酮試劑：稱取蒽酮0.2 g溶解于100 mL的95%硫酸中，置于棕色瓶中，于冷暗處保存（8～10 ℃暗處可保存20 d）。

1.2 儀器設(shè)備

日本島津UV-1700紫外可見分光光度計(jì)；德國(guó)賽多利斯ME235S-電子分析天平；梅特勒-托利多DELTA 320pH計(jì)；上海醫(yī)療器械五廠H·H·S21-6C電熱恒溫水浴鍋；天津市泰斯特儀器有限公司FZ102植物粉碎機(jī)；江蘇昆山超聲儀器公司KQ-50DB 超聲清洗器；陜西三原紅旗實(shí)業(yè)有限公司50 kg/h超聲逆回流連續(xù)提取機(jī)組。

1.3 方 法

1.3.1 原料的制備

以50 kg/h超聲逆回流連續(xù)提取機(jī)組提取杜仲粉或綠原酸后自然風(fēng)干的杜仲葉殘?jiān)鳛樵?，備用?/p>

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確吸取6.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得葡萄糖對(duì)照品溶液（0.396 0 g/L）。

精確吸取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別置于具塞刻度試管中，加水至1.0 mL。在冰水浴中緩慢精確加入蒽酮試劑4.0 mL，蓋上試管塞劇烈搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱6 min，取出迅速用自來水冷卻至室溫，放置10 min后，以加入1.0 mL水的試管中溶液為空白，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：A＝5.325 8c＋0.007 2，r＝0.998 1，葡萄糖在0.039 6～0.198 0 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 酶解單因素試驗(yàn)

精確稱取杜仲葉殘?jiān)?.00 g加75 mL指定pH值下的蒸餾水，水浴加熱至指定溫度，分別加入一定量已活化的纖維素復(fù)合酶（非酶解液不加酶），稱其質(zhì)量，在水浴中攪拌30 min后，酶解一定時(shí)間，再稱質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，充分搖勻后過濾，精確吸取續(xù)濾液10 mL置于50 mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精確吸取酶解液各1 mL（其中一份為空白樣），分別置于具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法進(jìn)行顯色，以空白樣為參比，用蒽酮-硫酸法測(cè)定其溶液濃度，計(jì)算酶解液中總糖的含量。

酶解后殘?jiān)?0 mL水沖洗至無色，于60 ℃烘干，充分揉搓將含膠絲部分和不含膠絲部分分開，分別稱取其質(zhì)量，將杜仲葉殘?jiān)z絲部分與石油醚按1︰10（g︰mL）的比例配比，用50 mL石油醚于65 ℃的水浴中回流提取1 h，趁熱用160目不銹鋼網(wǎng)過濾，濾液置于暗處自然冷卻至室溫，在4 ℃冰箱中放置30 min后過濾，真空干燥得杜仲粗膠。

1.3.3.1 溫度對(duì)酶解效果的影響

酶用量2.0 mg/g，pH值5.5左右，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度設(shè)置35、40、45、50、55、60 ℃ 6個(gè)水平，酶解平行做3份。

1.3.3.2 pH值對(duì)酶解效果的影響

水浴溫度50 ℃，酶用量為2.0 mg/g，酶解時(shí)間4 h，用Hac-NaAc緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，酶解平行做3份。

1.3.3.3 酶用量對(duì)酶解效果的影響

水浴溫度50 ℃，pH值5.5，酶解時(shí)間4 h，復(fù)合酶用量為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/g，酶解平行做3份。

1.3.3.4 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

水浴溫度50 ℃，pH值 5.5，酶用量1.6 mg/g，酶解時(shí)間為1、2、4、6、8、10 h，酶解平行做3份。

1.3.4 酶解正交試驗(yàn)

在討論各單因素影響的基礎(chǔ)上，為探討各工藝參數(shù)相互交叉的影響，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)以確定優(yōu)化的酶解工藝條件。復(fù)合酶水解纖維素等正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 纖維素復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)因素Table 1 Levels in orthogonal enzymolysis test by cellulose compound enzyme

1.3.5 酶預(yù)處理法最佳工藝條件驗(yàn)證

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定酶預(yù)處理工藝條件后，進(jìn)行酶預(yù)處理法最佳工藝條件和杜仲粗膠提取的驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)酶解效果的影響

由于酶預(yù)處理的原料量不變（5.00 g），酶解液中所增加的總糖量越多，酶解率就越高，即酶解液中所增加的總糖量可直接反應(yīng)酶解率的強(qiáng)弱。同時(shí)，由于所設(shè)計(jì)提取杜仲膠所用溶劑量和時(shí)間并不能達(dá)到全部提取出來的效果，當(dāng)酶解效果較好時(shí)，膠絲易與杜仲葉殘?jiān)撾x，分出含膠絲部分總量少但膠絲多，這樣杜仲膠得率的高低可直接反映酶解對(duì)提膠效果的影響。溫度對(duì)酶解效果的影響結(jié)果見表2。

表2 溫度對(duì)酶解效果的影響Table 2 Influence of temperature on enzymolysis effect

表2中結(jié)果表明，隨溫度升高酶解液中總糖量增加，即酶解率增高，粗膠量增加，這是由于酶的活性隨溫度的升高而逐漸增強(qiáng)，酶解率增高，酶解的效果致使杜仲膠與杜仲葉殘?jiān)撾x，杜仲膠浸出量增加。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，酶解液中總糖量反倒降低，即酶解率減少，這是由于溫度過高使酶變性，活性減弱，酶解率降低，同時(shí)酶解的效果致使杜仲膠與杜仲葉殘?jiān)撾x減少，杜仲膠浸出量減少。在50 ℃時(shí)，酶的活性最大，酶解率最高，杜仲膠浸出量最大。

2.1.2 pH值對(duì)酶解效果的影響

pH值對(duì)酶解效果的影響結(jié)果見表3。表3中結(jié)果表明，隨pH值升高，酶解液中總糖量增加，即酶解率增高，粗膠量增加，這是因?yàn)閜H值的變化對(duì)酶解過程影響較大，在較低的pH值下酶解活性隨pH值增加而增大，在pH值5.5時(shí)酶的活性最大，酶解率最高。當(dāng)pH值繼續(xù)升高，酶解液中總糖量反倒降低，即酶解率減少，這是由于pH值過高使酶變性，活性減弱，酶解率降低。

表3 pH值對(duì)酶解效果的影響Table 3 Influence of pH value on enzymolysis effect

2.1.3 酶用量對(duì)酶解效果的影響

酶用量對(duì)酶解效果的影響結(jié)果見表4。表4中結(jié)果表明，隨酶用量的增加酶解液中總糖量增加，即酶解率增高，在酶用量1.6 mg/g時(shí)酶解率最高。當(dāng)酶用量繼續(xù)增加，酶解液中總糖量變化不大，即酶解率不變，從生產(chǎn)成本方面考慮應(yīng)以1.6 mg/g酶用量為宜。

表4 酶用量對(duì)酶解效果的影響Table 4 Influence of enzyme dosage on enzymolysis effect

2.1.4 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

時(shí)間對(duì)酶解效果的影響結(jié)果見表5。表5中結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中總糖量逐漸增加，即酶解率增高，在酶解4 h時(shí)酶解率最高，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解液中總糖量基本無變化，這是因?yàn)槊概c原料作用需要一定的時(shí)間，時(shí)間過短酶不能充分與原料作用，達(dá)不到最佳酶解效果，時(shí)間過長(zhǎng)酶與原料已經(jīng)充分反應(yīng)，再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)提高酶解率。因此，從生產(chǎn)成本方面考慮應(yīng)以酶解4～6 h為宜。

表5 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Table 5 Influence of time on enzymolysis effect

2.2 正交試驗(yàn)

纖維素復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，復(fù)合酶水解纖維素等直觀分析結(jié)果見表7。從表7直觀分析結(jié)果可知，極差最大的為A因素，其次分別為C因素、D因素、B因素，說明對(duì)復(fù)合酶水解纖維素等得率影響最大的因素為A，其次分別為C、D、B。

表6 纖維素復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果L9(34)Table 6 Result of orthogonal enzymolysis test L9(34) by cellulose compound enzyme

復(fù)合酶水解纖維素等方差分析結(jié)果見表8。從表8中方差分析結(jié)果可知，A因素有極顯著意義（F＞F0.01），C、B和D因素?zé)o顯著性意義（F＜F0.1）。所以根據(jù)各因素k的變化率得出A因素選水平2，B因素選水平2，C因素選水平2，D因素選水平2，參考單因素試驗(yàn)結(jié)果確定最佳生產(chǎn)工藝條件為A2B2C2D2。

表7 纖維素復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析?Table 7 Intuitive analysis of orthogonal enzymolysis test result by cellulose compound enzyme

表8 纖維素復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析?Table 8 Variance analysis of orthogonal enzymolysis test result by cellulose compound enzyme

2.3 酶預(yù)處理法最佳工藝條件驗(yàn)證

通過上述單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了較優(yōu)的酶預(yù)處理工藝條件，即酶解pH值5.5，酶用量1.6 mg/g，水浴溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h。按照此工藝，稱取杜仲葉殘?jiān)?00.00 g，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行酶解、提膠，同時(shí)做不酶解的杜仲葉殘?jiān)峡瞻讓?duì)照，將各酶解液及非酶解液按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表9所示。

表9 酶預(yù)處理法最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果Table 9 Verification results of the best process conditions for enzyme pretreatment method

從表9可以看出，在相同的提取條件下，杜仲葉殘?jiān)?jīng)酶解預(yù)處理后膠的第1次提取率是未經(jīng)酶解原料的1.49倍。說明，杜仲葉殘?jiān)附忸A(yù)處理有利于杜仲葉殘?jiān)心z的提取。

3 結(jié) 論

本研究中以杜仲葉殘?jiān)附庖褐锌偺呛亢兔附馕锬z的提取率作為考察指標(biāo)。研究結(jié)果表明，最佳酶解預(yù)處理工藝條件為：酶解溫度50 ℃，酶解pH值5.5，酶解用量1.6 mg/g，酶解時(shí)間4 h，料液比1︰15 （g︰mL）。

與非酶解原料相比，杜仲葉殘?jiān)?jīng)酶解預(yù)處理后膠提取率是未經(jīng)酶解的1.49倍。說明纖維素復(fù)合酶可用于杜仲葉殘?jiān)崛《胖倌z的酶解預(yù)處理過程。

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