薛 波，丁之恩，李 茜，呂 萍，孫瀟輝，張繼剛，楊 松

（安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036）

山核桃Carya cathayensis屬胡桃科山核桃屬落葉喬木，較為耐陰，喜涼爽濕潤氣候和深厚肥沃土壤，是我國重要的食用干果和木本油料植物[1]。大別山山核桃主要分布于安徽省金寨縣的天堂寨、關廟鄉(xiāng)、吳家店、沙河鄉(xiāng)、燕子河及霍山縣等地方[2]。目前對大別山地區(qū)不同品種山核桃的研究，主要集中在其生態(tài)學特征方面[3-4]。隨著近代育種技術(shù)的不斷發(fā)展，植物研究正向著形態(tài)分類、地理分布、解剖學、細胞學、分子遺傳學等研究方向發(fā)展。同工酶是基因和性狀的連接物，具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既是生理指標，又是可靠的遺傳標志。同工酶技術(shù)，即采用凝膠電泳方法，將不同的同工酶酶帶分離開來，經(jīng)過染色形成酶帶譜，是遺傳育種、生長發(fā)育、物種起源等研究領域中的一種重要的研究工具，其分析結(jié)果也可用作鑒定生物基因型是否有差異的可靠指標[5]。舒英杰、周玉麗等人[6]在比較分析8份不結(jié)球蕓薹屬蔬菜種質(zhì)的POD、SOD和EST同工酶的基礎上對其進行了分類，分類結(jié)果與果實性狀的分類結(jié)果基本一致，說明同工酶法是可利用的。葉慶生、文李等人[7]利用同工酶和SDS-PAGE技術(shù)對蘭屬5個種和2個變種的11個品種進行了分類研究，得出了生化水平與傳統(tǒng)形態(tài)學的分類結(jié)果基本一致的觀點。然而，采用同工酶法研究大別山山核桃品種類型的文章還較少。為了給大別山山核桃資源的保護和利用提供理論依據(jù)，文中采用聚丙烯酰胺垂直平板凝膠電泳技術(shù)，通過POD同工酶分析對大別山山核桃進行了分類鑒定，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品為采自于安徽省大別山地區(qū)7個不同采樣地的不同類型的山核桃鮮葉，其采集地與種類編號詳見表1。將新鮮樹葉剪下后迅速放入玻璃瓶中，再將玻璃瓶放入裝有醫(yī)用冰袋的保溫瓶中，控制低溫，然后帶回實驗室后置于4 ℃的冰箱中短暫保存以備用。

表1 山核桃鮮葉樣品的采集地及其種類編號Table 1 The collecting areas and type number of fresh leaves in C. cathayensis

1.2 儀 器

微量（μL）進樣器,上海佳安分析儀器公司；高速冷凍離心機，DYCZ-28A型電泳槽，DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，上海歐翔科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

酶液制備：分別稱取7種不同采樣地的山核桃葉樣各1 g，置于預先冷卻的研缽中,加入5 mL樣品提取液（含6 mmol/L的巰基乙醇、5 mmol/L 的EDTA 0.05 mmol/L ，pH值為7.4的Tis-HCL緩沖液），液氮研磨至勻漿。4 ℃條件下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，將其上清液置于－20 ℃的冰箱中儲存以備用[8]。

制膠及電泳：制膠所用的分離膠質(zhì)量分數(shù)為7.5%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為4%。電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)（pH值為8.3），指示劑為溴酚藍，點樣量為20 μL，在4 ℃的冰箱中穩(wěn)壓電泳，開始的電壓為100 V，當溴酚藍進入分離膠與濃縮膠界面時，加壓到200 V，待溴酚藍指示劑到達分離膠末端1 cm處時結(jié)束電泳[9-11]。

染色：采用醋酸聯(lián)苯胺染色法[12]。

聚類分析：對POD同工酶酶帶進行辨認，利用DPS統(tǒng)計軟件多元分析中的0-1程序?qū)?shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，采用jaccard聚類距離和類平均法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD同工酶酶譜分析

大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃樣葉的POD同工酶掃描圖譜如圖1所示。由電泳掃描圖譜可見，整個酶譜共出現(xiàn)6條酶帶，分別以P1、P2、P3、P4、P5、P6表示，其Rf值在0.310～0.550之間變化。酶帶P4、P6的Rf值分別為0.380、0.550，這2條酶帶在酶譜中出現(xiàn)的位點相同，并且條帶清晰，這可能是大別山山核桃的特征譜帶。

圖1 大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃葉片的POD同工酶圖譜Fig.1 POD isoenzyme pattern in C. cathayensis leaves from seven sample areas in Dabie Mountain

由圖1可知，不同種類山核桃葉間酶帶的數(shù)量、酶帶的強弱和遷移距離都有一定的差異：①酶帶數(shù)量不同，即Ⅰ號樣葉有4條酶帶，Ⅱ、Ⅳ號樣葉都有3條酶帶，Ⅴ、Ⅶ號樣葉都有6條酶帶，Ⅵ號樣葉有5條酶帶；②酶帶的強弱不同，在P1位點上，Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ號樣葉的酶帶均是強帶，而Ⅵ號樣葉的酶帶卻是弱帶；在P2位點上，Ⅴ、Ⅶ號樣葉的酶帶均是弱帶；在P3位點上，Ⅴ、Ⅶ號樣葉的酶帶均是強帶；在P4位點上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ號樣葉的酶帶均是弱帶，而Ⅴ、Ⅶ號的酶帶均是強帶；在P5位點上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ號樣葉的酶帶均是弱帶，而Ⅴ、Ⅶ號的酶帶均為強帶；在P6位點上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ號樣葉的酶帶均為弱帶，而Ⅴ、Ⅶ號的酶帶均是強帶；③酶帶的特征性不同，在P1位點上，Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ號樣葉均有酶帶，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號樣葉均無酶帶；在P2和P3位點上，Ⅴ、Ⅶ號樣葉均有酶帶，而其他樣葉均無酶帶。

2.2 聚類分析

對大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃葉片的POD同工酶酶帶的辨認結(jié)果見表2，表2 中分別用1和0記錄條帶的有與無，形成1/0矩陣，再應用DPS進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)聚類分析結(jié)果可以明確如下兩點：親緣關系越近的種類，其遺傳距離越接近0；而親緣關系越遠的種類，則遺傳距離越接近1。從圖2中可以看出，在遺傳距離為0.4時，可將大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃分為5類：第1類為霍山縣的山核桃品種；第2類為水竹坪和燕子河的山核桃品種；第3類為天堂寨和關廟鄉(xiāng)的山核桃品種；第4類為吳家店的山核桃品種；第5類為沙河鄉(xiāng)的山核桃品種。當遺傳距離為0.6時，又可將其分為3類：第1類即霍山縣、水竹坪和燕子河的山核桃品種；第2類即天堂寨、關廟鄉(xiāng)和吳家店的山核桃品種；第3類即沙河鄉(xiāng)的山核桃品種。

表2 大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃葉片的POD同工酶酶帶Table 2 POD isoenzyme bands in C. cathayensis leaves from seven sample areas in Dabie Mountain

圖2 大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃聚類樹形圖Fig.2 Cluster dendrogram of C. cathayensis from seven sample areas in Dabie Mountain

3 結(jié)論與討論

對大別山地區(qū)7個采樣地的山核桃葉片的過氧化物同工酶酶譜進行了分析，結(jié)果總共分離出28條酶帶，不同采樣地的山核桃葉片同工酶酶帶數(shù)各為2～6條，遷移率Rf值在0.310～0.470之間變化。酶帶P5、P6均為大別山山核桃的特征譜帶。

聚類分析結(jié)果顯示，分類標準不同對大別山地區(qū)7 個采樣地的山核桃品種的分類結(jié)果則不同。分析中發(fā)現(xiàn)，當遺傳距離為0.4時，可以將7 個采樣地的山核桃品種分為5類；當遺傳距離為0.6時，可以分為3 類。綜合兩種分類結(jié)果來看，霍山縣、水竹坪和燕子河這3個采樣地的山核桃品種的親緣關系較近，天堂寨、關廟鄉(xiāng)和吳家店3個采樣地的山核桃品種的親緣關系也很近，只有沙河鄉(xiāng)與其他采樣地的山核桃的親緣關系較遠。

同時，同工酶表現(xiàn)型變化較大，因為同工酶不可能在一個組織或一個種中穩(wěn)定不變地表達，而要受到植物的階段發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的影響，從而使酶譜表現(xiàn)出假多型性。因此，在分析同工酶譜時，要注意植物的不同發(fā)育階段，從而找出重演性好的酶譜帶，特別是特征譜帶。因此，要盡可能增加試驗的重復次數(shù)，這樣的試驗才具有科學性。另外，酶譜分析作為一種表現(xiàn)除代表遺傳背景外，還受生理、人為等因素的干擾，所以，只有將酶譜分析方法與形態(tài)學、細胞學等其他方法結(jié)合起來進行分析，才能更準確地揭示不同品種間的親緣關系[14]。

參考文獻：

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