張日清，劉海龍,2，汪靈丹，金曉玲

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.林學(xué)院；b.風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002）

櫸樹Zelkova schneideriana屬于榆科櫸屬，落葉大喬木，國家二級保護(hù)植物，分布于我國淮河流域、秦嶺以南的長江中下游地區(qū)。櫸樹材質(zhì)優(yōu)良，是生產(chǎn)各類高檔家具和工藝品的上等木材，同時櫸樹也是深受人們喜愛的傳統(tǒng)色葉園林風(fēng)景樹種[1-3]。

由于櫸樹用途廣泛，現(xiàn)階段已被過度采伐，因此目前櫸樹資源非常緊缺。植物組培技術(shù)是對植物進(jìn)行繁育與保育的一種重要技術(shù)手段。特別是利用芽器官的以芽繁芽技術(shù)是當(dāng)前組培工廠化育苗的常用技術(shù)手段，被廣泛應(yīng)用于桉樹、香蕉等苗木的大規(guī)模繁育[4-5]。

櫸樹的芽器官繁殖技術(shù)，前人已經(jīng)有了大量的研究報告。金曉玲[6-7]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，櫸樹組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)中，生根的最適培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基。實生苗幼嫩莖段在WPM＋BA1.0 mg/L培養(yǎng)基上直接形成叢生芽。汪靈丹等[8]研究發(fā)現(xiàn)，櫸樹最佳增殖培養(yǎng)基是WPM＋4.0 BA mg/L，最大增殖系數(shù)為15。

櫸樹組培繼代增殖技術(shù)是櫸樹芽器官繁殖技術(shù)的關(guān)鍵，得到大量健康的叢生芽是實現(xiàn)櫸樹組培工廠化育苗的前提。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，研究影響櫸樹組培繼代芽增殖效果及生長狀況的幾種因子，以期獲得更多更健壯的組培繼代增殖芽進(jìn)入生根培養(yǎng)階段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)的材料共有4種來源。第1種：以櫸樹幼嫩莖段為外植體，經(jīng)過初代誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)后，取試管腋芽叢生芽中的單個芽為試驗材料（見圖1）。第2種：櫸樹幼嫩的頂芽經(jīng)過消毒后存活，從初代培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)階段（見圖2）。第3種：櫸樹幼嫩莖段，經(jīng)過初代誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)后，取試管腋芽單芽為試驗材料（見圖3）。第4種：對櫸樹種子進(jìn)行無菌播種，發(fā)芽后直接剪取萌發(fā)芽轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)階段[9]（見圖4）。

圖1 試管腋芽叢生芽Fig.1 In vitro clustered shoots from axillary bud

圖2 幼嫩的頂芽Fig.2 A tender terminal bud

圖3 試管腋芽單芽Fig.3 A shoot in vitro from axillary bud

圖4 無菌播種的萌發(fā)芽Fig.4 A bud obtained through aseptic seeding

1.2 繼代增殖培養(yǎng)的試驗方案

1.2.1 基本培養(yǎng)基及植物激素對繼代增殖效果的影響

為了更準(zhǔn)確詳細(xì)地研究櫸樹繼代培養(yǎng)的增殖問題，采用4因素3水平L9(34)正交設(shè)計方案進(jìn)行試驗設(shè)計（見表1）。取大小一致的無菌芽苗，苗高約1.0 cm，每組接種10瓶，每瓶接種1株，每個處理重復(fù)2次?；九囵B(yǎng)基設(shè)置3個水平：A1（MS）、A2（WPM）、A3（改良MS）。NAA設(shè)置3個水平：B1（0 mg/L）、B2（0.5 mg/L）、B3（1.0 mg/L）。KT設(shè)置3個水平：C1（0 mg/L）、C2（1.0 mg/L）、C3（2.0 mg/L）。BA設(shè)置3個水平：D1（0 mg/L）、D2（1.0 mg/L）、D3（4.0 mg/L）。

1.2.2 抗氧化劑和吸附劑抑制褐化的效果

對比活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）三者在櫸樹繼代增殖培養(yǎng)過程中的抗褐化能力的強弱以及對生長的影響。AC 2.0 g/L，PVP 2.0 g/L，Vc 15 mg/L，每個處理15瓶，留15瓶作為空白對照。培養(yǎng)基選用WPM＋BA 1.0 mg/L，培養(yǎng)基中添加瓊脂4.0 g/L，蔗糖30 g/L，pH值調(diào)至5.8。

1.2.3 材料來源對繼代增殖效果的影響

針對櫸樹繼代增殖培養(yǎng)過程中，芽體愈傷化現(xiàn)象嚴(yán)重這一問題，對比4種來源材料的愈傷產(chǎn)生情況，研究不同材料的適宜增殖方法。

表1 繼代增殖試驗設(shè)計方案L9(34)Table 1 The orthogonal test L9(34) plan of multiplication of subculture buds mg·L-1

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基及植物激素對繼代芽增殖效果的影響

將第1種來源的材料，即誘導(dǎo)萌發(fā)的腋芽叢生芽，自基部切離，接種到繼代培養(yǎng)基上，每處理接種10瓶，每瓶接種1株，每處理重復(fù)2次。培養(yǎng)35 d后，調(diào)查統(tǒng)計芽增殖及生長情況，結(jié)果見表2。

采用直觀分析法，對芽增殖倍數(shù)這個指標(biāo)進(jìn)行分析。影響增殖倍數(shù)的指標(biāo)從主到次為：BA（極差3.90）、KT（極差1.10）、NAA（極差0.67）、基本培養(yǎng)基（極差0.63）。方差分析結(jié)果顯示：4個因素中因素D（BA）達(dá)到顯著水平（F＝32.819＞F0.05＝19.000）。均值（k）表明，最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即WPM＋NAA 0.5 mg/L＋KT 2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L培養(yǎng)基，但本試驗中不含該組合，因為正交試驗是一種均一性試驗設(shè)計，不可能含所有處理組合[10-11]。但根據(jù)表1仍可選出較好的處理組合A1B3C3D3，即MS＋NAA 1.0 mg/L＋KT2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L，也可達(dá)較好的增殖效果，增殖率為5.5。

表2 培養(yǎng)35 d時芽平均增殖倍數(shù)和芽長Table 2 Bud proliferation coefficient and length after 35 days

采用直觀分析法，對芽長這個指標(biāo)進(jìn)行分析。影響芽長的指標(biāo)從主到次為：NAA（極差0.867）、KT（極差0.733）、基本培養(yǎng)基（極差0.466）、BA（極差0.400）。方差分析結(jié)果顯示：4個因素均未達(dá)到顯著水平。均值（k）表明，最優(yōu)組合為A2B3C3D1，即WPM＋NAA 1.0 mg/L＋KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基，櫸樹繼代芽可以達(dá)到較好的抽長效果。

2.2 抗氧化劑和吸附劑抑制褐化的效果

在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或活性炭，對防止某些植物培養(yǎng)物的褐變具有一定的效果。3種抗氧化劑和吸附劑抑制繼代芽褐變的效果見表3。結(jié)果表明，2.0 g/L PVP具有良好的抑制繼代芽褐變的作用，加入該物質(zhì)后，繼代芽幾乎無褐化現(xiàn)象發(fā)生。即使偶爾出現(xiàn)少量褐化，也只發(fā)生在葉片，對芽體生長無明顯損害。15 mg/L Vc對繼代芽褐化無明顯抑制作用。而添加2.0 g/L AC，也對繼代芽的褐化無抑制作用（見圖5），芽體在添加活性炭的培養(yǎng)基中褐化，繼代芽在添加活性炭的培養(yǎng)基中前期生長健康，葉片顏色轉(zhuǎn)為深綠色，但培養(yǎng)15 d后繼代芽會出現(xiàn)明顯玻璃化的現(xiàn)象（見圖6）。

表3 抗氧化劑和吸附劑的防褐化效果?Table 3 Inhibition effect of antioxidants or adsorbents on browning

圖5 芽體褐化Fig.5 Bud browning

圖6 芽體玻璃化Fig.6 Bud vitri fication

2.3 材料來源對繼代芽增殖效果的影響

第1種來源的材料（即試管腋芽叢生芽），由于在初代培養(yǎng)時能吸收來自母株莖段的大量營養(yǎng)，因此生長健壯，木質(zhì)化程度較高。這類材料可使用WPM＋NAA 0.5 mg/L＋KT 2.0 mg/L＋BA 4.0 mg/L培養(yǎng)基，獲得高的增殖系數(shù)。

第2種來源的材料（即幼嫩的頂芽），該材料直接來自母株，大多數(shù)頂芽由于過于細(xì)嫩，在消毒時易被殺死，因此得到這類芽的幾率較小，這類芽在添加BA的培養(yǎng)基上極易出現(xiàn)愈傷化，愈傷化能導(dǎo)致整個芽體被包埋而死亡（見圖7）。因而，這類芽不適宜在添加BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使用KT代替BA，雖然增殖系數(shù)降低，但避免了愈傷化現(xiàn)象的發(fā)生，保證了繼代芽的健康生長。

第3種來源的材料（即試管腋芽單芽）和第4種來源的材料（即無菌播種的萌發(fā)芽）同第2種材料，芽較細(xì)弱，使用KT代替BA，能取得較好的繼代培養(yǎng)效果，芽健壯（見圖8）。第2種、第3種和第4種來源的材料經(jīng)過數(shù)代繼代增殖培養(yǎng)后，芽體木質(zhì)化程度逐漸增強，可轉(zhuǎn)入添加BA的培養(yǎng)基中。

圖7 頂芽愈傷化Fig.7 Terminal bud with callus formation

圖8 無菌播種的萌發(fā)芽產(chǎn)生增殖芽Fig.8 Proli firation bud from plantlet after aseptic seeding

3 結(jié)論與討論

活性炭是吸附性較強的無機吸附劑，但它并沒有選擇性，在吸附酚類物質(zhì)的同時，也把培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)吸附掉，短時間內(nèi)對培養(yǎng)物沒有影響，時間長了外植體就因缺少營養(yǎng)而枯死[12]。前人分析凡是能夠鈍化多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等酶系統(tǒng)活性的抗氧化劑，理論上都具有阻礙或防止外植體褐變的作用[13]。但某些抗氧化劑（如Vc）不耐高溫。而PVP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑[14-15]，且耐高溫，選擇PVP作為防止褐變物質(zhì)從理論上是可行的。本試驗中選用了PVP控制櫸樹組培繼代芽褐變，取得了顯著效果。

前人已經(jīng)對櫸樹組培做過大量研究。但大多數(shù)研究者并沒有提到愈傷化的現(xiàn)象。筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，櫸樹組培繼代增殖過程中的愈傷化嚴(yán)重危害櫸樹組培繼代芽的健康生長。KT可以在前幾代繼代培養(yǎng)過程中暫時替代BA，不產(chǎn)生愈傷的同時，取得一定的增殖效果。但其作用并不穩(wěn)定，即有時可以取得3倍甚至4倍的增殖效果，有時又不發(fā)生增殖。因而KT的增殖效果在穩(wěn)定性上較BA差，在后期繼代培養(yǎng)過程中KT不能完全代替BA。

觀察發(fā)現(xiàn)：木質(zhì)化程度高的繼代芽在繼代增殖過程中不易產(chǎn)生愈傷。因此通過各種途徑提高組培繼代芽的木質(zhì)化程度至關(guān)重要?；九囵B(yǎng)基、光照、溫度、瓊脂等都是優(yōu)化的對象，如果能迅速提高組培繼代芽的木質(zhì)化程度，則能避免愈傷的產(chǎn)生，從而大幅度提高櫸樹繼代增殖的效率。

后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，用IBA替代NAA或者直接去掉培養(yǎng)基中的生長素，可以減緩愈傷組織的產(chǎn)生，而對櫸樹組培繼代培養(yǎng)的增殖倍數(shù)等重要參數(shù)不產(chǎn)生明顯影響。因而后期的繼代增殖培養(yǎng)基中只采用BA和KT的組合作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。

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