黃少勇，張智俊，羅淑萍，李 疆

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，浙江 臨安 311300）

山核桃Carya cathayensisSarg. 為胡桃科Juglandaceae，山核桃屬CaryaNutt.，是中國(guó)特有的一種木本油料和干果樹(shù)種，其種下無(wú)品種[1]，山核桃屬植物適應(yīng)能力強(qiáng)、用途多，含油率高，果品營(yíng)養(yǎng)豐富、有很好的醫(yī)療保健作用，是重要的木本油料樹(shù)種和干果樹(shù)種，也是珍貴的用材樹(shù)種，在中國(guó)廣為種植[2]。同時(shí)，山核桃樹(shù)體高大，枝葉繁茂,根系發(fā)達(dá),固土力強(qiáng),是經(jīng)國(guó)家林業(yè)局認(rèn)定的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)兼用型樹(shù)種[3]。山核桃屬植物在我國(guó)主要有5個(gè)種，浙江山核桃C. cathayensisSarg是浙江省的主要經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種之一[4]。近年來(lái)，人們生活水平不斷提高，對(duì)山核桃的需求量不斷上升。我國(guó)是山核桃原產(chǎn)地，栽培歷史悠久，但其相關(guān)研究報(bào)道尤其在分子水平上的研究報(bào)道甚少。為了更好地開(kāi)發(fā)利用山核桃資源，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益，非常有必要對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的遺傳學(xué)研究。目前，針對(duì)山核桃的研究較多采用以下幾種分子標(biāo)記技術(shù)：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ampli fied fragment length polymorphism，AFLP）[5-6]，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（random ampli fied polymorphic DNA，RAPD）[7-8]，微衛(wèi)星間隔片段多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）[9]，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related ampli fied polymorphism，SRAP）[4]。但是對(duì)山核桃進(jìn)行相關(guān)的EST-SSR研究的報(bào)道較為鮮見(jiàn)，僅有宋雙等[10]基于山核桃脂肪代謝相關(guān)cDNA文庫(kù)設(shè)計(jì)了34對(duì)引物，并對(duì)天然群體山核桃40個(gè)樣品進(jìn)行了初步的應(yīng)用性試驗(yàn)，但是該研究需要構(gòu)建cDNA文庫(kù)。本試驗(yàn)中從NCBI上搜尋核桃的EST序列，根據(jù)這些序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，既避免了構(gòu)建cDNA文庫(kù)的麻煩，又獲得較好的擴(kuò)增效果。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）又稱為微衛(wèi)星序列，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[11]。SSR又可分為基因組SSR和ESTSSR，表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星（EST-SSR）是一種基于EST的簡(jiǎn)單重復(fù)序列設(shè)計(jì)的一種新型分子標(biāo)記，盡管不同植物開(kāi)發(fā)的EST序列中SSR分布的頻率差異較大，但其中2%～5%序列中均含有SSR，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和試驗(yàn)成本的降低，公共數(shù)據(jù)庫(kù)EST數(shù)量的急速增加，為植物EST-SSR的開(kāi)發(fā)提供了豐富的極有價(jià)值的可利用資源[12]。由于EST來(lái)源于編碼cDNA，通常其序列保守性程度較高，已有很多研究表明EST標(biāo)記在家族和種屬間的通用性較高[13]。故本研究中擬通過(guò)核桃屬的EST序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)山核桃進(jìn)行多態(tài)性研究，檢驗(yàn)及篩選引物，以期為山核桃種質(zhì)資源評(píng)價(jià)開(kāi)發(fā)更好更有效的引物，為后期的雜交育種親本的選配、遺傳圖譜構(gòu)建等工作提供資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究中采用的24份山核桃樣品采自浙江省臨安市，27份核桃樣品采自新疆鄯善縣。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

目前，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList）網(wǎng)站上可搜尋到5 213條核桃的EST序列，將這些序列進(jìn)行初步的篩選后（去掉冗長(zhǎng)序列），利用Websat在線軟件（http://wsmartins.net/websat/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再將設(shè)計(jì)好的引物序列交由上海生物工程科技有限公司合成，設(shè)計(jì)的20對(duì)引物序列的信息詳見(jiàn)表1。

表1 20對(duì)EST-SSR引物序列?Table 1 20 pairs of EST-SSR primer sequences

1.2.2 基因組DNA提取

每份材料采4～5片幼葉，用硅膠干燥保存?；蚪MDNA的提取采用改良的CTAB法，參照Doyle[14]的方法稍作修改。具體操作如下。

（1）取少量研磨好的樣品倒入離心管中，樣量為覆蓋管底即可，加入預(yù)熱（65 ℃）的溶液Ⅰ600 μL（具體配方見(jiàn)表2），充分混勻，再加B-巰基乙醇12 μL，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清。

表2 溶液I的配方?Table 2 Formula of the solution I

（2）加入預(yù)熱（65℃）CTAB提取液600～800 μL，加入B-巰基乙醇12 μL，上下顛倒混勻，65 ℃水浴35 min，每隔10 min左右溫和混勻1次。

（3）4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清約600 μL裝入新離心管中，再加入預(yù)冷的氯仿異戊醇600 μL，緩慢搖勻至乳濁狀。

（4）4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇，并加入5 mol/L的醋酸鈉200 μL，搖勻至乳濁狀。

（5）4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清?？筛鶕?jù)離層情況重復(fù)上一步驟，若不重復(fù)上一步則加入2倍體積的預(yù)冷的冷無(wú)水乙醇，然后加入3 mol/L的醋酸鈉200 μL。

（6）4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，防止將沉淀倒出，將液體倒凈，然后加入75%的乙醇約500 μL，使沉淀懸浮，常溫下放置2～3 min。

（7）短暫離心后棄上清，晾干2～3 min，加入50 μL ddH2O，在－20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取出的樣品DNA經(jīng)過(guò)UV-2401PC微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度后，根據(jù)OD260/OD280值判斷其純度，然后將每份樣品DNA稀釋為50 ng/μL，再取每份樣品各10 μL用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，之后于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

20對(duì)EST-SSR引物中進(jìn)行混合DNA樣品的篩選之后，將多態(tài)性較好的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增儀為Gene Amp PCR System 9700，電泳儀為BIO-RAD POWER PAC3000，電泳槽為北京市六一儀器廠DYCZ-30C。EST-SSR反應(yīng)體系為 20 μL，包括 2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）10 μL，上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 45 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；之后72 ℃充分延伸7 min。最后4 ℃保存。

1.2.4 電泳和銀染

PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠在160 V電壓下電泳1 h。然后進(jìn)行銀染，銀染液的配制及操作方法根據(jù)Panaud等[15]的方法進(jìn)行改良。10%酒精與0.5%冰乙酸混合液固定12 min，水洗；1%硝酸銀進(jìn)行染色15 min，水洗；1%硫代硫酸鈉浸泡凝膠30 s以上，水洗；1.5%氫氧化鈉（2.5 mL/L甲醛）顯影至條帶清晰。銀染后拍照并用保鮮膜保存好凝膠，將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置有帶記為“0”，帶型不清或數(shù)據(jù)缺失記為“－”，獲得“0/1”數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算每對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC，polymorphism information content）[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用NTSYS-pc[17]生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件導(dǎo)入矩陣，獲得遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA方法進(jìn)行聚類作圖。并利用Popgen32[18]軟件進(jìn)行多態(tài)性數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果分析

以24份山核桃和27份核桃的DNA為模板，用設(shè)計(jì)合成的20對(duì)引物進(jìn)行篩選，共獲得了6對(duì)多態(tài)性較好的擴(kuò)增引物，見(jiàn)表3。

采用6對(duì)引物組合進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，條帶清晰，擴(kuò)增片斷的長(zhǎng)度范圍為100～2 000 bp（見(jiàn)圖1、圖2）；共檢測(cè)出46個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為41個(gè)，每對(duì)引物的多態(tài)位點(diǎn)百分率在75%～100%之間，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為89.45%。引物擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC，polymorphism information content）在76.01%～90.01%之間，平均為83.64%，證明基于核桃ESTs數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的SSR引物有很好的通用性，可用于山核桃的遺傳分析。

利用Popgen32軟件對(duì)0/1矩陣進(jìn)行運(yùn)算，獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)顯示，觀測(cè)等位基因數(shù)平均為1.869 6個(gè)，有效等位基因數(shù)為1.623 4，Nei基因多樣性為0.344 7，香農(nóng)指數(shù)I為0.502 3。

表3 6對(duì)EST-SSR引物序列的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Result of 6 pairs of EST-SSR primer sequences amplification

圖1 24份山核桃PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of 24 samples in C. cathayensis

圖2 27份核桃PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of 27 walnut samples

2.2 聚類分析

使用NTSYSpc生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算山核桃與核桃個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到聚類樹(shù)形圖（見(jiàn)圖3）。結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.73時(shí)，山核桃與對(duì)照普通核桃可以很好地區(qū)分開(kāi)，表明引物的有效性較好，亦能較好地反映出種屬間的差異。

圖3 51份材料的EST-SSR數(shù)據(jù)UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of EST-SSR data from 51 samples

3 結(jié)論與討論

本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了6對(duì)在核桃屬間具有較好通用性的引物組合。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，6對(duì)引物組合能將核桃與山核桃很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，也能較好地進(jìn)行山核桃內(nèi)部分類。

（1）EST-SSR標(biāo)記的通用性以及多態(tài)性 作為基因的一部分，EST-SSR側(cè)翼序列在物種間高度保守，因此EST-SSR引物可在物種之間通用[19]。雖然EST的保守性在一定程度上限制了EST標(biāo)記的多態(tài)性，但是仍然有少量引物的多態(tài)性較高，而且其屬間的通用性較好，EST-SSR分子標(biāo)記又是一種較為快速有效且成本低廉的技術(shù)。近年來(lái)，隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷豐富，EST-SSR技術(shù)得到更多的應(yīng)用。尤其在植物中，鄭麗珊等[20]對(duì)棉花SSR分子標(biāo)記在香蕉中的通用性進(jìn)行了研究，157對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增到1 188個(gè)條帶，平均7.6個(gè)；引物的多態(tài)信息含量范圍在0.58～0.91之間。廖嬌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，基于獼猴桃EST序列而篩選的SSR引物在柑橘類植物中具有一定的通用性。姚利華[22]利用蘋果屬開(kāi)發(fā)的EST-SSR引物對(duì)梨屬的4個(gè)種或品種中擴(kuò)增出目的產(chǎn)物的有72對(duì)，其中多態(tài)性引物40對(duì)，又隨機(jī)選取8對(duì)在24個(gè)梨屬植物的種或品種上進(jìn)行了擴(kuò)增，所選引物在這些材料上均擴(kuò)增出了與在蘋果屬上大小相似的預(yù)期產(chǎn)物，一共產(chǎn)生了59個(gè)等位基因,平均每對(duì)引物7.375個(gè)，揭示了它們之間較近的親緣關(guān)系。本研究中平均擴(kuò)增條帶數(shù)為7.67，與上述研究的擴(kuò)增結(jié)果相似。引物多態(tài)性信息含量為83.64%，與鄭麗珊等人的研究結(jié)果吻合。

（2）山核桃資源的遺傳多樣性 本研究結(jié)果初步表明，EST-SSR適用于山核桃的遺傳多樣性分析，同時(shí)表明山核桃與普通核桃的相似性較低，相似度僅為0.50，證明它們之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。但是山核桃屬內(nèi)相似性較高，相似度為0.73～0.96。將山核桃屬內(nèi)各樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，樣品L1與其它樣品的差異最大，此外其它樣品可以很明顯地分為I和II 2個(gè)類群（見(jiàn)圖3）。假設(shè)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有較大誤差，樣品L1遺傳差異大的原因可能是樣品本身序列非常特殊，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，然后與其它山核桃的序列進(jìn)行對(duì)比。

從目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看，運(yùn)用EST-SSR標(biāo)記對(duì)山核桃進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)分類的相關(guān)報(bào)道較少，本研究中利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘工具，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡桃屬EST序列中開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證通用性良好，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。下一步將利用本研究所篩選出的EST-SSR標(biāo)記引物對(duì)不同種源的山核桃群體進(jìn)行分析，進(jìn)一步為山核桃進(jìn)行品種鑒定以及資源保護(hù)提供可靠的依據(jù)。

（3）試驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果的影響 在試驗(yàn)方法中，不同的方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響也各不相同。如基因組的提取，本研究中采用了DNA混合池的方法，與邵俊培等[23]的方法相似，即將所有樣品的DNA各取少量混合進(jìn)行引物組合的篩選。這樣做不僅可以節(jié)約時(shí)間，而且不必消耗大量的試驗(yàn)材料，還可以獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果。在DNA提取方法上，本研究采用改良的CTAB法，獲得較好的DNA樣品。梁玉琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)CTAB法提取DNA質(zhì)量低，分別采用改良CTAB法和植物基因組DNA提取試劑盒2種方法，改良CTAB法能夠獲得高濃度的DNA。在引物設(shè)計(jì)方法上，較多學(xué)者采用SSRHunter軟件，如齊建勛等[25]以及吳碩等[26]，而本研究中采用Websat在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，雖然方法不同，但是獲得的引物組合效果也較好，而且該軟件簡(jiǎn)單易用，設(shè)計(jì)耗費(fèi)的時(shí)間較短。

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