張志忠，石秋香，孫志浩，藍茂鋒

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州350002）

空心蓮子草（Alternantheraphiloxeroides），莧科蓮子草屬，原產(chǎn)南美，現(xiàn)已蔓延成為一種世界性的惡性雜草，適應(yīng)廣泛，在雜草的生存競爭中占有絕對的優(yōu)勢［1］，入侵后對局部生態(tài)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［2］，2003年被列入國家環(huán)?？偩止嫉摹爸袊谝慌鈦砣肭稚锩麊巍敝校?］。入侵雜草會對當?shù)氐纳锒鄻有栽斐蓢乐赜绊懀茐脑衅胶?，加之大多防除困難，嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。Callaway和Aschehoug［4］認為，化感作用是外來雜草成功入侵的“化學武器”，并提出“化學武器”假說。目前化感作用研究已成為應(yīng)對外來植物入侵的一個重要領(lǐng)域［5－7］，相關(guān)研究廣泛的涉及到對植物的生長，呼吸、光合作用，酶的活性，水分及礦物質(zhì)元素代謝等多方面的影響。但由于化感物質(zhì)來源廣泛，在植物中含量極微，收集和結(jié)構(gòu)鑒定難度大，加之其分泌和作用過程受到外界環(huán)境影響較大，關(guān)于化感作用的機理研究還不充分。

目前國內(nèi)外對空心蓮子草的研究主要集中在生物學特征、對周邊環(huán)境的表觀影響和防除技術(shù)3個方面［8－11］，關(guān)于其化感作用的研究還處于起步階段，且大多集中在對水稻（Oryzasativa）等大田作物的影響方面。一般認為空心蓮子草會降低水稻種子發(fā)芽率，顯著影響水稻產(chǎn)量［12，13］；但也有研究表明其對水稻的最終發(fā)芽率沒有影響，空心蓮子草釋放的化感物質(zhì)影響了水稻的保護酶系統(tǒng)［14］，以蠶豆（Viciafaba）和玉米（Zeamays）為材料的研究也得出了類似的結(jié)論［15］。這些研究結(jié)果說明空心蓮子草對其他植物的化感表現(xiàn)較復雜，其化感機理有待于進一步研究。本研究以2種化感作用研究中常用的敏感模式蔬菜類型蘿卜（Raphanussativus）和生菜（Lactuca sativa）作為受體［16，17］，通過測定空心蓮子草水浸提液對二者種子萌發(fā)、幼苗生長和體內(nèi)保護酶系統(tǒng)及 MDA含量的變化，探討空心蓮子草對受體植物的化感效應(yīng)及其生理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

空心蓮子草（Alternantheraphiloxeroides）采自福建農(nóng)林大學植物園，蘿卜和生菜種子購于福建省種子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 空心蓮子草植株水浸提液的制備 實驗于2011年3－8月在福建農(nóng)林大學園藝學院基礎(chǔ)實驗室進行，將采集到的新鮮空心蓮子草洗凈剪成小段，置于黑暗的烘箱（60℃）中烘干、研磨。在室溫的條件下，稱取4g樣品，加入100mL蒸餾水充分振蕩浸提48h，雙層紗布過濾1次后，用雙層濾紙過濾2次，再用0.2μm孔徑47mm直徑的微孔濾膜（Supor－200）過濾，無菌雙蒸水定容，制得濃度為0.04g/mL的浸提液母液。用滅菌蒸餾水依次稀釋出0.01，0.02，0.03，0.04g/mL的濃度配比，滅菌蒸餾水作為對照。使用前取出室溫放置一段時間，使其自然冷卻至室溫，以免驟冷對蔬菜種子、幼苗造成傷害。

1.2.2 蘿卜和生菜的種子處理 挑選均勻、飽滿的蘿卜和生菜種子，先用10%H2O2對種子消毒，無菌蒸餾水沖洗后分別播種于墊有2層定性濾紙的培養(yǎng)皿（90mm）中，播種密度為30粒/皿，每培養(yǎng)皿加不同濃度浸提液4 mL，用無菌蒸餾水處理作對照，濾紙和培養(yǎng)皿均做無菌處理。培養(yǎng)皿用保鮮膜包好，防止水分蒸發(fā)和污染，在室溫條件下暗培養(yǎng)發(fā)芽，每隔24h觀察1次，3d更換1次新鮮浸提液和濾紙，以連續(xù)5d不再有新種子發(fā)芽作為實驗結(jié)束的標記，計算最終發(fā)芽率（發(fā)芽種子數(shù)目/播種種子總數(shù)）。實驗重復3次。

1.2.3 幼苗生長情況和保護酶系統(tǒng)相關(guān)指標測定 將蘿卜和生菜種子25℃催芽至剛露白后每個培養(yǎng)皿放30粒，加入上述各濃度水浸液4mL，用無菌蒸餾水處理作對照，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25℃（晝）/18℃（夜），濕度80%，光照6 000lx。每24h觀察幼苗生長狀況，7d后取樣，用于幼苗胚軸長度、胚根長度和植株鮮重的測定。幼苗胚軸長度和胚根長度采用直尺測定，植株鮮重采用電子天平直接稱重。利用無菌蒸餾水培養(yǎng)獲得3d苗齡的蘿卜和生菜幼苗，采用上述同樣處理方法和培養(yǎng)條件，3d后用于保護酶活性相關(guān)指標測定。過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑法、過氧化氫酶（CAT）活性測定采用碘量滴定法、丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［18］。實驗重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

化感效應(yīng)指數(shù)按照 Willamson和Richardson［19］的方法計算，當T≥C時，RI＝1－C/T；當T＜C時，RI＝C/T－1。式中，C為對照值，T為處理值，RI為化感效應(yīng)指數(shù)。RI＞0時為促進作用，RI＜0時為抑制作用，其絕對值大小反映化感作用的強弱。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 16.1軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜種子萌發(fā)的影響

空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜種子的發(fā)芽率均產(chǎn)生抑制，隨著處理濃度的增加，這種抑制作用逐步增強。高濃度浸提液處理嚴重抑制了種子萌發(fā)，即使能夠萌發(fā)也很快腐爛或壞死（圖1）?？傮w而言，空心蓮子草植株水浸提液對生菜的化感效應(yīng)強于蘿卜，當濃度為0.04g/mL時，二者的化感效應(yīng)指數(shù)分別為－0.429和－0.767。

圖1 不同濃度空心蓮子草植株水浸提液處理下的蘿卜和生菜種子發(fā)芽率Fig.1 The germination rate of radish and lettuce seed treated with different concentration of aqueous extracts fromA.philoxeroides

2.2 空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜幼苗生長的影響

不同濃度空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜幼苗的生長總體上表現(xiàn)為抑制作用，相對而言對幼苗根系的抑制作用要明顯大于對地上部的抑制作用，其中對胚根長度和植株鮮重2個指標表現(xiàn)為持續(xù)性抑制，隨著處理濃度的升高對胚根長度和植株鮮重抑制作用逐步增強（圖2）。當浸提液濃度達到0.04g/mL時，根系的生長幾乎停滯，此時對蘿卜和生菜根系生長的化感指數(shù)分別為－0.926和－0.806；對植株鮮重而言，生菜所受到的抑制作用較蘿卜嚴重，二者的化感指數(shù)分別為－0.452和－0.161。低濃度（0.01g/mL）浸提液對胚軸的生長表現(xiàn)出促進作用，隨濃度升高，對生菜而言當濃度超過0.01g/mL后這種促進作用逐步減弱，達到0.03g/mL時已表現(xiàn)為抑制；但在蘿卜中沒有表現(xiàn)類似的規(guī)律性。當濃度達到0.04g/mL時，蘿卜和生菜的胚軸生長均被抑制，其化感指數(shù)分別為－0.184和－0.182。

2.3 空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜幼苗保護酶活性的影響

圖2 不同濃度空心蓮子草植株水浸提液處理下的蘿卜和生菜幼苗生長相關(guān)指標Fig.2 The growth indexes of radish and lettuce seedlings treated with different concentration of aqueous extracts fromA.philoxeroides

圖3 不同濃度空心蓮子草植株水浸提液處理下的蘿卜和生菜幼苗的保護酶活性Fig.3 The protective enzyme activity of radish and lettuce seedlings treated with different concentration of aqueous extracts fromA.philoxeroides

空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜幼苗各種保護酶活性的影響表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律（圖3）。對SOD活性而言浸提液處理對生菜的影響較明顯，尤其是在0.03g/mL濃度處理下其幼苗體內(nèi)的SOD活性顯著下降，較對照低44.5%。對蘿卜而言SOD活性最初呈上升趨勢，在濃度達到0.03g/mL時出現(xiàn)峰值，開始下降?？招纳徸硬萁嵋禾幚韺OD活性的影響較為復雜，大致表現(xiàn)出升－降－升的規(guī)律，生菜POD活性的變化更為劇烈一些，二者均在0.01g/mL濃度處理時達到峰值，此后活性下降；當濃度進一步增加時，活性又開始上升，濃度達到0.04g/mL時蘿卜的POD活性略高于對照，生菜的仍顯著高于對照。低濃度（≤0.02g/mL）的空心蓮子草浸提液處理對CAT活性的影響不明顯，當濃度達到0.03g/mL時，蘿卜和生菜的CAT活性均出現(xiàn)了顯著上升，生菜的漲幅高達387.85%；處理濃度繼續(xù)提高后蘿卜體內(nèi)的CAT活性繼續(xù)緩慢上升，而生菜的CAT活性則顯著下降，但二者的CAT活性仍顯著高于對照。

2.4 空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜幼苗丙二醛（MDA）含量的影響

蘿卜和生菜幼苗的MDA含量均隨空心蓮子草植株水浸提液濃度增加而升高，其中蘿卜的增幅略大于生菜，但在處理濃度為0.01～0.03g/mL，二者的MDA含量的增加均不顯著（圖4）。當浸提液濃度為0.04g/mL時，與對照組相比，蘿卜的丙二醛含量增加了116.67%，生菜為98%。其化感指數(shù)分別為0.538和0.495。

圖4 不同濃度空心蓮子草植株水浸提液處理下的蘿卜和生菜幼苗的MDA含量Fig.4 The MDA content of radish and lettuce seedlings treated with different concentration of aqueous extracts fromA.philoxeroides

3 討論

空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜種子的發(fā)芽率均產(chǎn)生抑制，隨著處理濃度的增加，這種抑制作用逐步增強，相對而言對幼苗根系的抑制作用要明顯大于對地上部的抑制作用，這和張遠兵等［13］在水稻中的研究結(jié)果一致。幼苗根系最先受到空心蓮子草植株水浸提液的影響，生長受到抑制，進而影響其吸收功能，不能給幼苗提供足夠養(yǎng)分和水分，最終對地上部的生長產(chǎn)生抑制?？招纳徸硬萃ㄟ^抑制其他植物種子發(fā)芽和幼苗生長，有利于入侵植物對周邊空間的占領(lǐng)，可能是其得以迅速蔓延的原因之一，在對其他入侵植物的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，且一般而言水浸提液的濃度越高抑制效果越強［20］。但這種抑制作用在不同受體植物間表現(xiàn)略有差異，如本實驗中蘿卜種子萌發(fā)受到的抑制作用較小，可能是較生菜而言蘿卜種皮相對較厚，浸提液中的化感物質(zhì)透過種皮影響種子萌發(fā)所需時間較長。

POD、SOD、CAT三者組成的保護酶系統(tǒng)對于維持植物細胞自由基處于較低水平有重要作用，雜草往往通過化感作用影響植物的保護酶系統(tǒng)，降低植物清除自由基的能力，使其抗性減弱，生長受抑［21－23］。POD活性被認為是植物對環(huán)境變化的敏感指標之一，一般在老化組織中活性較高，通常被認為是組織老化的一個重要生理指標。實驗中低濃度的空心蓮子草水浸提液處理后可誘導其活性增強，清除自由基的危害，此后活性逐步下降，當濃度繼續(xù)升高時，組織開始衰老并迅速死亡、腐敗，過氧化物酶活性再次升高；在這一過程中生菜的變化較為劇烈，這可能與其組織耐受性較差有關(guān)，即使發(fā)芽的生菜幼苗隨處理濃度增加也很快褐化死亡，而蘿卜幼苗抵抗力相對較強；上述POD活性的變化規(guī)律與實驗中種子萌發(fā)和幼苗生長的觀測結(jié)果一致。SOD的活性在低濃度處理條件下變化不大，呈小幅上升趨勢，但隨著處理濃度增加急劇下降?？傮w而言POD和SOD活性隨著處理濃度由低到高表現(xiàn)出先上升再下降的規(guī)律，可能原因是低濃度的脅迫可以誘使二者活性上升，清除自由基的能力增強，隨著處理濃度進一步增加超過了其調(diào)節(jié)范圍，酶活性被抑制，植物損傷加劇，這和在對紅車軸草（Trifoliumpratense）化感作用的研究中得出的結(jié)論類似［15］。CAT活性的提高會加速植株的衰老，降低植株抗性，空心蓮子草植株浸提液處理后幼苗體內(nèi)的過氧化氫酶活性總體表現(xiàn)出上升趨勢。細胞膜是細胞與外界環(huán)境之間的一道屏障，逆境對植物的傷害首先是引起細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，導致膜透性增大，丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量常用來衡量植物受活性氧的傷害程度。逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧清除能力下降是引起丙二醛大量積累的主要原因。由本實驗可以看出不同濃度的空心蓮子草植株水浸提液處理后，蘿卜和生菜幼苗的丙二醛含量持續(xù)增加，說明其膜脂過氧化現(xiàn)象越來越嚴重，這和張遠兵等［13］在水稻中的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明空心蓮子草植株水浸提液對受體植物蘿卜和生菜表現(xiàn)出了明顯的化感效應(yīng)，受體植物的種子萌發(fā)和幼苗的生長總體上被抑制，各種保護酶活性的變化可能是其內(nèi)在的生理基礎(chǔ)之一。由于化感作用涉及影響因素極多，本研究僅對空心蓮子草植株水浸提液對蘿卜和生菜2種受體植物的化感效應(yīng)進行了初步研究，增加受體植物的類型，探討脅迫過程中光合作用、呼吸作用和水分代謝等方面的變化，分析并克隆空心蓮子草化感作用相關(guān)基因，這些方面還有待于進一步深入研究。

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