劉妮娜，李曉東，張金政，王亮生，孫國(guó)峰，林秦文，徐彥軍

（1.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京100093；2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100094）

玉簪屬（Hosta）植物為百合科（Liliaceae）重要的耐蔭觀葉地被植物，世界各地廣泛栽培。該屬野生資源主要分布于東亞的溫帶與亞熱帶地區(qū)，包括中國(guó)的東部和南部、朝鮮、日本及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)，包括43種、35變種/變型。玉簪屬植物18世紀(jì)傳入歐洲，19世紀(jì)末傳入美國(guó)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的栽培及雜交育種已選育出栽培品種超過(guò)4 000個(gè)，其中注冊(cè)品種超過(guò)2 000個(gè)［1，2］。該屬植物除是重要的園林觀賞植物外，亦具有悠久的藥用歷史，“玉簪”之名始見于《本草綱目》［3］，其全草、根、莖及花均可入藥，具有清熱解毒、散結(jié)消腫之功效，主要治療乳癰、瘡癰潰瘍、毒蛇咬傷［4］；蒙古醫(yī)學(xué)以花入藥，治療咽喉腫痛、音啞、肺熱［5］。玉簪花的藥用價(jià)值很大程度上與其含有的類黃酮化合物有關(guān)，解紅霞等［5］對(duì)玉簪（Hostaplantaginea）花進(jìn)行化學(xué)成分研究，95%乙醇滲濾液的乙酸乙酯萃取部分得到山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercertin）、山奈酚3－O－蕓香糖苷（kaempfeml－3－O－rutinoside）、山奈酚－7－O－β－D－葡萄糖苷（kaempferol－7－O－β－D－glucoside）；石油醚萃取物中經(jīng)硅膠柱色譜依次用石油醚—乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物為正二十烷酸 （eicosanoic acid）和棕櫚酸－α－單甘油酯 （hexadecanoic acid 2，3－dihydroxypropyl ester）［5，6］。2003年，鐘國(guó)躍等［7］研究發(fā)現(xiàn)紫萼玉簪（H.ventricosa）對(duì)早期、中期炎癥均有較強(qiáng)的抑制作用。類黃酮化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物，常以游離態(tài)或糖苷形式存在，具有多方面生物活性，包括：抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老以及抗輻射等［8－13］。

玉簪屬植物種質(zhì)資源非常豐富，遍布世界各地，從目前查閱到的國(guó)內(nèi)外研究文獻(xiàn)來(lái)看，人們更加重視玉簪屬植物根葉部位的成分研究，而對(duì)玉簪屬植物花的藥用價(jià)值研究還很有限，缺少進(jìn)一步應(yīng)用該屬植物花朵的理論依據(jù)。因此應(yīng)該加大對(duì)該屬植物花朵部位化學(xué)成分研究及活性成分篩選的力度，以發(fā)現(xiàn)該屬植物的新用途，以更好的造福人類。本研究擬對(duì)玉簪屬5個(gè)野生種和85個(gè)栽培品種花瓣中類黃酮成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離鑒定，為進(jìn)一步豐富玉簪屬植物資源的利用提供科學(xué)依據(jù)［14，15］。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

試驗(yàn)材料為玉簪屬5個(gè)野生種和85個(gè)栽培品種（表1）的盛花期花瓣，均于2010年6－10月，采自中國(guó)科

學(xué)院植物研究所植物園玉簪種質(zhì)資源圃（39°48′N，116°28′E，海拔76m）。所有試驗(yàn)材料均采用相同的栽培措施（包括相同的施肥、灌溉及病害防治等）?；ò瓴杉笾糜冢?0℃冰箱保存，用于后續(xù)分析。

表1 玉簪野生種、品種表Table 1 Hostaspecies and cultivars

試劑：乙腈和甲醇（色譜純）購(gòu)于北京先明樂施科技發(fā)展有限公司。三氟乙酸（≥99%）購(gòu)于德國(guó)Merck公司（Darmstadt，Germany）。甲醇（分析純）和甲酸（分析純）購(gòu)自北京化工廠。HPLC級(jí)水由 Milli－Q超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA，USA）制備。黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品：蘆?。兌?1.7%）、山奈酚3，7－二葡萄糖苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，用于黃酮醇定性定量分析。

1.2 類黃酮化合物提取

每個(gè)處理稱取2g花瓣材料，加液氮研磨成粉末，溶于5mL甲醇－甲酸（98∶2，V/V）的抽提溶劑，黑暗條件下4℃浸提24h，期間每隔6h于旋轉(zhuǎn)振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，江蘇）振蕩混勻1次。之后超聲振蕩30min，離心（12 000r/min，10min），收集上清液。濾渣分次加入3mL，2mL抽提液，進(jìn)行第2、3次的抽提，合并收集的上清液。0.22μm尼龍微孔濾膜過(guò)濾后保存在－20℃冰箱，用于HPLC－DAD或HPLC－MSn分析。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 類黃酮化合物定性、定量分析

采用 Agilent 1100LC/MSD Trap VL 液質(zhì)聯(lián)用儀（HPLC－ESI－MSn）進(jìn)行類黃酮定性分析。色譜條件為：采用TSK gel ODS－80Ts QA（150mm×4.6mm，5μm i.d.，Tosoh，Tokyo，Japan）色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)350nm；流動(dòng)相組成：A相0.1% 甲酸－水溶液；B相0.1%甲酸－乙腈溶液，洗脫程序：0min，5%B；10min，10%B；12min，11.7%B；15min，12%B；35min，13.4%B；40min，20%B；55min，29%B；60min，5%B；流速0.8mL/min；溫度35℃，進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜電離源采用電噴霧電離（ESI），分別在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，掃描范圍：（m/z）100～1 000u。正離子模式下質(zhì)譜分析條件為：氮?dú)庾鳛楦稍锖蛧婌F氣體，干燥溫度350℃，氮?dú)饬魉?.0 L/min，噴霧器壓力：241.3kPa；毛細(xì)管電壓：3 500kV，毛細(xì)管出口電壓：140V；八級(jí)射頻電壓振幅：150Vpp；skim 1電壓：55.6V，skim 2電壓：6.0V；cap exit offset，84.4V。負(fù)離子模式下，參數(shù)設(shè)定值不同的為：毛細(xì)管出口電壓：－127.3V；skim 1電壓：－47.7V，skim 2電壓：－6.0V；cap exit offset，－79.6V。用 LC/MSD Trap軟件（5.2版本）分析不同模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。依據(jù)樣品HPLC分析的保留時(shí)間、洗脫順序、紫外－可見吸收光譜和質(zhì)譜信息，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品以及參考文獻(xiàn)［12－14］比較得出類黃酮化合物的結(jié)構(gòu)。

采用Dionex HPLC系統(tǒng)進(jìn)行類黃酮化合物定量分析。該系統(tǒng)包括P680泵、TCC－100自動(dòng)控溫柱箱、PDA－100光電二極管陣列檢測(cè)器。色譜條件與類黃酮化合物定性分析一致。利用標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁分別對(duì)黃酮/黃酮醇總量（TF）進(jìn)行半定量分析，重復(fù)3次，單位為每克新鮮花瓣中含有的毫克數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析、主成分分析，并用SigmaPlot 10.0對(duì)數(shù)據(jù)作盒須圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定了方法的靈敏度。結(jié)果表明，在所檢測(cè)的濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)值與濃度高度線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r2＞0.999 3。LOD為0.229μg/mL；LOQ為0.764μg/mL（表2）。

表2 分析方法的線性檢驗(yàn)（y＝kx＋m）及檢測(cè)限、定量限Table 2 Linearity of response for rutin using the separate method（Calibration fitting：y＝kx＋m）and LOD，LOQ

2.2 玉簪屬植物類黃酮化合物定性分析

表3列出了玉簪花中檢測(cè)到的類黃酮化合物的紫外可見吸收光譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)［16－20］。其中，負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了更多信息［20］。共發(fā)現(xiàn)3種黃酮醇苷元和1種黃酮苷元，分別為：kaempferol（1，2，4，5，6，7，8，9，13，14，15，16和17）、quercetin（11，12）、isorhamnetin（3）和luteolin（10）（表3、圖1）。

表3 玉簪類黃酮組分的紫外—可見吸收光譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 3 HPLC－DAD and HPLC－ESI－MSn analysis as well as the structure characterization and tentative identification of glycosides of flavone，flavonol in petals of Hosta

圖1 灰黑葉玉簪（左）和披針葉玉簪（右）黃酮類組成的HPLC圖譜（檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm）Fig.1 DAD－chromatogram of flavonoids recorded at 350nm of H.nigrescens（left）and H.lancifolia（right）

HPLC－ESI－MSn分析結(jié)果表明，組分1通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的共洗脫和紫外吸收光譜的比較鑒定為山奈酚3，7－二葡萄糖苷（kaempferol 3，7－di－O－glucoside，Km3G7G）。組分2，3，8，9（圖1）的質(zhì)譜裂解行為與kaempferol 3，7－di－O－glucoside相似，表明它們是黃酮醇3，7－二糖苷。此類化合物在負(fù)離子模式下的碎片離子可以提供糖苷化位置的可靠信息［20］。在黃酮醇糖苷的MS2質(zhì)譜中，準(zhǔn)分子離子［M－H］－失去3－位的糖基產(chǎn)生的離子記為Y03－，而失去7－位糖基的記為Y07－。由于［M－H］－更容易失去7－位上的糖基，Y07－的相對(duì)豐度通常比Y03－高［21］。根據(jù)以上原理，將組分2，3，9分別推定為山奈酚 3－葡萄糖－7－蕓香糖苷（kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose），異鼠李素3，4－二葡萄糖苷（isorhamnetin 3，4－di－O－glucoside）［19］和山奈酚3－葡萄糖－7－鼠李糖苷（kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rhamnoside）。組分8的MS2質(zhì)譜信息與1相同，且8的洗脫順序在后，推測(cè)可能是半乳糖參與了糖苷化，由于沒有更多的證據(jù)，暫將8推定為山奈酚3，7－二己糖苷（kaempferol 3，7－di－O－h(huán)exoside）。

組分4，5和6的［M－H］－離子在MS2分析中都有丟失碎片m/z174u，m/z206u，m/z158u的現(xiàn)象，推測(cè)這3個(gè)化合物為黃酮醇的?；咸烟擒?。將組分4，5和6的紫外吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品Km3G7G進(jìn)行比較，推定4為山奈酚3－奎尼酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－quinoylglucoside）、5為山奈酚 3－芥子酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－sinapoylglucoside）、6為山奈酚3－抗壞血酰葡萄糖苷（kaempferol 3－O－ascorbicoylglucoside）。

10號(hào)峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示是木犀草素的衍生物，MS2質(zhì)譜中只能觀察到m/z447（［M－H－146u］－），而沒有m/z431（［M－H－162u］－），表明木犀草素是被一種雙糖糖苷化的。根據(jù)碎片m/z449（［M＋H－146u］＋）的相對(duì)豐度大于m/z287（［Y0＋，M＋H－（146＋162）u］），判斷雙糖之間的糖苷鍵是1→2連接方式［20］。再比較10號(hào)峰的紫外吸收光譜，最終將10號(hào)峰推定為木犀草素7－新橙皮糖苷（luteolin 7－O－neohesperidoside）。同樣，將7號(hào)峰推定為山奈酚7－新橙皮糖苷（kaempferol 7－O－neohesperidoside），13號(hào)峰被推定為山奈酚3－刺槐二糖甙（kaempferol 3－O－robinobioside）［22］。

組分11，正離子模式下檢測(cè)到高豐度的苷元離子m/z303（Y0＋），負(fù)離子模式下檢測(cè)到相應(yīng)的離子m/z301（Y0－）。再結(jié)合它們?cè)谏V柱中的洗脫順序和紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)，組分11被推定為槲皮素衍生物。組分11在（＋）ESI－MS下的分子離子m/z465（［M＋H］＋）和（－）ESI－MS下的去質(zhì)子分子離子m/z463（［M－H］－）表明糖基為一個(gè)己糖分子。而負(fù)離子模式下相對(duì)高豐度的自由基苷元離子m/z300（［Y0－H］－）說(shuō)明糖基化位置在3位上。組分11最終確定為槲皮素3－葡萄糖苷 （quercetin 3－O－glucoside）［23］。根據(jù)紫外可見吸收光譜，洗脫順序，負(fù)離子模式下的分子離子m/z477（［M－H］－），正離子模式下的分子離子m/z501（［M＋Na］＋），組分12被推定為槲皮素3－葡萄糖酸苷（quercetin 3－O－glucuronide）［24］。

組分13鑒于紫外最大吸收波長(zhǎng)265nm（Band II）［22］，正離子模式下的苷元碎片離子m/z287（Y0＋）以及負(fù)離子模式下的苷元離子m/z285（Y0－）和自由基苷元離子m/z284（［Y0－H］］－）。組分14和15在正離子模式下檢測(cè)到顯著的加鈉分子離子m/z471（［M＋Na］＋），負(fù)離子模式下檢測(cè)到去質(zhì)子分子離子m/z447（［MH］－），分子量正好是在山奈酚分子量的基礎(chǔ)上加上一個(gè)己糖的分子量162u，由此確定組分14的結(jié)構(gòu)為山奈酚3－葡萄糖苷（kaempferol 3－O－glucoside），組分15為山奈酚3－葡糖苷酸（kaempferol 3－O－glucuronide）。

16號(hào)峰正離子模式下檢測(cè)到顯著的加鈉分子離子m/z441（［M＋Na］＋）和苷元離子m/z287（Y0＋），負(fù)離子模式下也檢測(cè)到相應(yīng)的分子離子m/z417（［M－H］－）和自由基苷元離子m/z284（［Y0－H］－），這些都是戊糖苷化的山奈酚或木犀草素的特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)。同時(shí)該化合物在265nm，而不是255nm有最大吸收，即是山奈酚的紫外特征吸收。但尚無(wú)法確實(shí)戊糖是木糖還是阿拉伯糖，因此組分16暫定為山奈酚3－戊糖苷（kaempferol 3－O－pentose）。

在負(fù)離子模式下，當(dāng)苷元的3－位發(fā)生糖苷化時(shí)，［Y0－H］－的相對(duì)豐度大于Y0－；而7－位發(fā)生糖苷化時(shí)則相反，Y0－的相對(duì)豐度更高［20］。并且2種糖苷的紫外特征吸收波長(zhǎng)不同，類黃酮7－糖苷的特征吸收帶I與3－糖苷相比發(fā)生紅移［25］。根據(jù) MS和 UV光譜數(shù)據(jù)（表3），推定17號(hào)峰為山奈酚7－葡萄糖苷（kaempferol 7－O－glucoside）。

2.3 玉簪屬植物類黃酮化合物定量分析

為了進(jìn)一步篩選應(yīng)用價(jià)值大的玉簪種質(zhì)，首先依據(jù)類黃酮化合物成分對(duì)選定的玉簪種質(zhì)進(jìn)行聚類分析（圖2）。當(dāng)選取5為聚類距離時(shí)，玉簪分為2類。通過(guò)比較2類玉簪種質(zhì)的類黃酮組成，發(fā)現(xiàn)I類中kaempferol 3，7－di－O－h(huán)exoside、kaempferol 3－O－glucuronide含量相對(duì)較高，II類中kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高。進(jìn)一步依據(jù)玉簪類黃酮化合物含量進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)聚類分析中I類主要分布在組分8，15得分值高的區(qū)域；II類主要分布在組分2得分值高的區(qū)域（圖3）。分別對(duì)I、II類作盒須圖（圖4），可以更加清晰明了的看出2類的區(qū)別。在以kaempferol 3，7－di－O－h(huán)exoside、kaempferol 3－O－glucuronide為主成分的I類中，山地玉簪（H.montana）為kaempferol 3，7－di－O－h(huán)exoside含量最高的品種，達(dá)到1.41mg/g。玉簪‘蒙特利爾’（Hosta‘Montrealensis’）為kaempferol 3－O－glucuronide含量最高的品種，達(dá)到1.08mg/g。在II類當(dāng)中，野生種披針葉玉簪（H.lancifolia）為kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高的玉簪種質(zhì)，達(dá)到2.11mg/g，同時(shí)披針葉玉簪還是類黃酮總量最高的玉簪種質(zhì)，達(dá)到2.94mg/g（表4）。

圖2 玉簪聚類樹形圖Fig.2 Hierarchical diagram showing the classification results using cluster analysis of the flavonoids profile

圖3 主成分因子得分圖Fig.3 PCA scatter diagram of samples based on flavonoids profile

圖4 不同玉簪品種中類黃酮組成Fig.4 Flavonoids constitutions from different species and cultivars of Hosta

表4 玉簪花的類黃酮組成及定量分析Table 4 Flavonoid constitutions and relative quantity of flavonoid in Hosta mg/g

續(xù)表4 Continued

續(xù)表4 Continued

3 結(jié)論

目前，從植物中尋找具有各種生物活性的天然化合物備受人們關(guān)注。玉簪屬植物不僅是重要的耐蔭觀葉地被植物，由于其多個(gè)部位均可入藥，在民間及蒙藥中廣泛應(yīng)用于乳癰、咽喉腫痛、肺熱等多種炎癥的治療。玉簪屬植物類黃酮化合物組成有其特殊性，但相關(guān)研究卻一直沒有引起人們的足夠重視。到目前為止，僅見解紅霞等［5］對(duì)玉簪花的類黃酮成分的初步研究，得到山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercertin）、山奈酚3－O－蕓香糖苷（kaempfeml－3－O－rutinoside）和山奈酚－7－O－β－D－葡萄糖苷（kaempferol－7－O－β－D－glucoside）。為豐富玉簪屬植物的開發(fā)利用，有必要利用高效液相色譜（HPLC－DAD）技術(shù)，建立了定量分析玉簪花中類黃酮化合物的HPLC方法，可作為玉簪花藥材的質(zhì)量控制方法。同時(shí)結(jié)合質(zhì)譜（MSn）技術(shù)，鑒定了玉簪花瓣中類黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并篩選出其富含類黃酮化合物的種質(zhì)資源。

本研究以玉簪屬5個(gè)野生種和85個(gè)栽培品種的花瓣為材料，利用高效液相色譜（HPLC－DAD）結(jié)合質(zhì)譜（MSn）技術(shù)，鑒定了玉簪花瓣中17種類黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為：山奈酚3，7－二葡萄糖苷、山奈酚3－葡萄糖－7－蕓香糖苷、異鼠李素3，4－二葡萄糖苷、山奈酚3－奎尼酰葡萄糖苷、山奈酚3－芥子酰葡萄糖苷、山奈酚3－抗壞血酰葡萄糖苷、山奈酚7－新橙皮糖苷、山奈酚3，7－二己糖苷、山奈酚3－葡萄糖－7－鼠李糖苷、木犀草素7－新橙皮糖苷、槲皮素3－葡萄糖苷、槲皮素3－葡糖苷酸、槲皮素3－刺槐二糖苷、山奈酚3－葡萄糖苷、山奈酚3－葡糖苷酸、山奈酚3－戊糖苷和山奈酚7－葡萄糖苷。并比較了90種玉簪花中類黃酮化合物成分與含量的差異性，篩選出類黃酮化合物含量較高的種類：山地玉簪（H.montana）為kaempferol 3，7－di－O－h(huán)exoside含量最高的品種；玉簪‘蒙特利爾’（Hosta‘Montrealensis’）為kaempferol 3－O－glucuronide含量最高的品種；野生種披針葉玉簪（H.lancifolia）為kaempferol 3－O－glucosyl－7－O－rutinose含量最高的玉簪種質(zhì)，同時(shí)也是類黃酮總量最高的玉簪種質(zhì)。

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