鄭琳琳，王佳，賀龍梅，王學(xué)峰，王迎春＊

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古和信園蒙草抗旱綠化股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021）

“牧草之王”紫花苜蓿（Medicagosativa）是全世界栽培歷史最悠久、種植面積最廣、利用價(jià)值最高的一種豆科多年生優(yōu)質(zhì)牧草，廣泛種植于以畜牧業(yè)為支柱產(chǎn)業(yè)的中國(guó)西北地區(qū)［1－2］。然而這些地區(qū)多具有干旱、高鹽、低溫等生境特點(diǎn)，嚴(yán)重制約著苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段培育具有多重抗逆能力的優(yōu)良品種，對(duì)于苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有舉足輕重的作用。

在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的防御機(jī)制中，Ca2＋作為第二信使發(fā)揮著重要的作用［3］。CIPK（CBL－interacting protein kinase）是近年來(lái)鑒定的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可與上游植物特有的Ca2＋傳感器鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白（calcineurin B－like proteins，CBLs）結(jié)合，識(shí)別并傳遞胞質(zhì)鈣信號(hào)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列應(yīng)激反應(yīng)［4－5］。通過(guò)生物信息學(xué)分析，在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）和水稻（Oryzasativa）基因組中分別發(fā)現(xiàn)26和30個(gè)CIPK基因［6］，后在銀楊（Populustrichocarpa）［7］、葡萄（Vitisvinifera）［8］、高粱（Sorghumbiocolor）［9］和玉米（Zeamays）［10－11］中相繼獲得多個(gè)CIPK家族成員。多項(xiàng)研究表明，CIPK廣泛參與植物對(duì)高鹽、低鉀和干旱等外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)［12－14］，在擬南芥、水稻、煙草（Nicotianatabacum）等植物中過(guò)量表達(dá)不同CIPK基因均可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力［15－18］。

本實(shí)驗(yàn)以唐古特白刺（Nitrariatangutorum）cDNA為模板，利用PCR技術(shù)克隆獲得NtCIPK2完整編碼序列（complete coding sequence，CDS），在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有該序列的植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及RT－PCR驗(yàn)證，獲得了超表達(dá)NtCIPK2基因的轉(zhuǎn)化植株，為利用轉(zhuǎn)基因手段選育抗逆苜蓿新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)于2012年9月開始進(jìn)行。紫花苜蓿“中苜一號(hào)”種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所孫啟忠研究員惠贈(zèng)。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pPZP221由內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、壯觀霉素（spectinomycin，Spe）、慶大霉素（gentamycin，Gen）、頭孢霉素（cefotaxime，Cef）等抗生素購(gòu)自Sigma公司；2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－dichlorophenoxyacetic acid，2，4－D）、激動(dòng)素（kinetin，KT）、6－芐氨基腺嘌呤（6－benzylaminopurine，6－BA）、萘乙酸（1－naphthylacetic acid，NAA）等植物激素購(gòu)自Sangon公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司，Taq酶、Marker購(gòu)自TransGen公司；總RNA分離采用RNAiso試劑（Takara），cDNA合成采用 M－MLV Reverse Transcriptase Kits反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），基因組DNA提取采用Plant Genomic DNA Kit試劑盒（Tiangen）；寡核苷酸引物合成和產(chǎn)物測(cè)序由Invitrogen公司承擔(dān)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化所需培養(yǎng)基如下：無(wú)菌苗生長(zhǎng)，1/2MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基；預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)培養(yǎng)基，MS＋2mg/L 2，4－D＋0.5mg/L KT；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS＋2mg/L 2，4－D＋0.5mg/L KT＋500mg/L Cef；分化培養(yǎng)基，MS＋0.5mg/L 6－BA＋0.05mg/L NAA＋200mg/L Cef＋30mg/L Gen；生根培養(yǎng)基，1/2MS＋0.3%活性炭。

1.2 研究方法

1.2.1NtCIPK2CDS的克隆 按照RNAiso總RNA抽提試劑盒的操作說(shuō)明提取唐古特白刺葉片總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠鑒定其質(zhì)量和完整性；利用M－MLV Reverse Transcriptase Kits反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并最終將其稀釋為20ng/μL。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提交的NtCIPK2序列（GenBank登錄號(hào)KC823044），設(shè)計(jì)1對(duì)用于擴(kuò)增其編碼區(qū)cDNA的引物［NCF：5′－CGCGGATCCATGATGGAACACAA－3′和 NCR：5′－CGGGGT ACCCTAATGGTAATGCT－3′］。酶切位點(diǎn)用下劃線表示，分別為BamHⅠ和KpnⅠ。以合成的cDNA作為模板，利用高保真酶擴(kuò)增NtCIPK2 CDS。PCR反應(yīng)體系為25μL，內(nèi)含2mmol/L Mg2＋、200μmol/L dNTPs、引物各1.0μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0U，20ng模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物插入pMD－19Tsimple載體（Takara）中，命名為pMD－Nt－CIPK2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌體PCR檢測(cè)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 選取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切pMD－NtCIPK2和pPZP221質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠檢測(cè)后回收目的片段，T4DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有Spe抗性的LB（Luria－Bertani）平板中篩選陽(yáng)性菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)和雙酶切鑒定，獲得植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化 采用CaCl2凍融法將植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，在篩選培養(yǎng)基（LB＋50mg/L Rif＋100mg/L Spe＋50mg/L Gen）上獲得轉(zhuǎn)化菌落，經(jīng)PCR鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

選取顆粒飽滿的苜蓿種子，利用75%的酒精和0.1%的HgCl2溶液分別消毒1和10min，無(wú)菌水清洗3～5次，用滅菌濾紙吸干種子上的多余水分，置于1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)。切取7d齡無(wú)菌苗的下胚軸作為受體材料，預(yù)培養(yǎng)3d后，將其浸泡于活化的農(nóng)桿菌菌液中侵染15min，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中避光生長(zhǎng)3～5d。形成愈傷組織后，經(jīng)分化篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)得到紫花苜?？剐赞D(zhuǎn)化植株。待再生苜蓿根與地上部分均長(zhǎng)至10cm左右時(shí)，移入營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)設(shè)計(jì)1對(duì)引物［aacC1F：5′－GGATCGTCACCGTAATCTGCT－3′和 aacC1R：5′－GCTCCGTAGTAAGACATTCATCG－3′］，用于擴(kuò)增載體中的慶大霉素抗性基因aacC1，擴(kuò)增長(zhǎng)度為246bp。以轉(zhuǎn)基因抗性苜蓿的基因組DNA作為模板，質(zhì)粒pPZP221和野生型紫花苜蓿基因組DNA為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳分析。PCR反應(yīng)體系為25μL，內(nèi)含2mmol/L Mg2＋、200μmol/L dNTPs、引物各1.0 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，20ng模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；然后94℃變性20s，55℃退火20s，72°C延伸20s，共35個(gè)循環(huán)。

提取轉(zhuǎn)化植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用NCF和NCR引物擴(kuò)增目的基因。質(zhì)粒pPZP221－NtCIPK2和野生型紫花苜蓿cDNA用作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。PCR體系和反應(yīng)條件與NtCIPK2基因克隆相同，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確定NtCIPK2基因在苜蓿中的整合及表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCIPK2基因CDS的獲得

以唐古特白刺cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條1362bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到載體pMD－19T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明該片段與GenBank中公布的序列完全一致，成功的克隆獲得NtCIPK2的CDS。

2.2 植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2的鑒定

以pPZP221為基本骨架，通過(guò)雙酶切切出的末端之間的連接將外源基因NtCIPK2插入其中，獲得植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2（圖2）。提取重組質(zhì)粒，應(yīng)用NCF和NCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示均擴(kuò)增出1350bp左右的預(yù)期片段（圖3）；同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳分析表明重組質(zhì)?？梢郧谐鰞蓚€(gè)片段，大片段為載體序列，約為9.8kb，小片段為NtCIPK2基因，約為1.4kb（圖4）。

圖1 NtCIPK2基因CDS的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of NtCIPK2CDS

圖2 植物表達(dá)載體pPZP221－NtCIPK2質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of plant transformation vector pPZP221－NtCIPK2

2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

隨機(jī)挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行PCR鑒定，均可擴(kuò)增出目的條帶（圖5），表明載體pPZP221－NtCIPK2已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可用于后續(xù)苜蓿的轉(zhuǎn)化。

2.4 紫花苜蓿抗性轉(zhuǎn)化植株的獲得

將預(yù)培養(yǎng)的紫花苜蓿下胚軸，加入活化的農(nóng)桿菌中侵染15min，共培養(yǎng)3d后，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15d左右，形成愈傷組織（圖6A），將淺黃色的愈傷組織分別接入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至綠色再生芽產(chǎn)生（圖6B），最后切下再生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生成再生植株（圖6C），經(jīng)煉苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)（圖6D）。

2.5 再生植株的檢測(cè)

對(duì)獲得的7株抗性幼苗進(jìn)行慶大霉素抗性基因aacC1的鑒定，PCR產(chǎn)物電泳分析表明所有幼苗均克隆得到長(zhǎng)約250bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖7），證明外源基因確已整合到紫花苜?；蚪M中。

圖3 pPZP221－NtCIPK2的PCR鑒定Fig.3 PCR analysis of pPZP221－NtCIPK2

圖4 pPZP221－NtCIPK2的雙酶切鑒定Fig.4 Double digestion of pPZP221－NtCIPK2

同時(shí)對(duì)抗性苗進(jìn)行NtCIPK2基因的RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示其中的3株擴(kuò)增獲得大小一致的目的條帶，其他4株幼苗無(wú)擴(kuò)增條帶（圖8），這可能是由于基因插入位點(diǎn)的差異引發(fā)的基因沉默所致。結(jié)果說(shuō)明NtCIPK2基因在3株轉(zhuǎn)基因幼苗中可以正常表達(dá)。

3 討論

圖5 pPZP221－NtCIPK2導(dǎo)入農(nóng)桿菌的PCR檢測(cè)Fig.5 PCR analysis of pPZP221－NtCIPK2transformed Agrobacterium tumefaciens

自1986年Deak等［19］首次報(bào)道利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗逆苜蓿植株以來(lái)，利用基因工程手段提高苜?？鼓嫘誀钜殉蔀檐俎ＳN的重要途徑［20－24］。將擬南芥冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtCBF1［25］和AtCBF2［26］導(dǎo)入和田苜?；颉癏unter－river”苜蓿中，經(jīng)PCR檢測(cè)得到了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，為紫花苜?？购缕贩N的選育奠定了基礎(chǔ)；燕麗萍等［27－29］采用分子生物學(xué)檢測(cè)手段和不同濃度NaCl對(duì)轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶BADH基因苜蓿進(jìn)行研究，證實(shí)BADH基因可以穩(wěn)定遺傳，且轉(zhuǎn)基因苜蓿耐鹽性明顯高于對(duì)照，最終獲得綜合性狀優(yōu)良的耐鹽苜蓿新品種“山苜2號(hào)”；李燕等［30］構(gòu)建了紫花苜蓿MsZIP基因超表達(dá)載體并對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該基因的超表達(dá)可以提高苜蓿的耐鹽性和耐旱性；Liu等［31］將角果堿蓬（Suaedacorniculata）液泡膜Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ScNHX1和液泡質(zhì)子ATP酶ScVP基因共轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株在鹽脅迫和鹽堿復(fù)合脅迫條件下存活，而野生植株則萎黃死亡；在紫花苜蓿過(guò)量表達(dá)蘇打豬毛菜（Salsolasoda）SsNHX1基因，成功獲得迄今所有報(bào)道中耐鹽能力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化植株，可以在400mmol/L NaCl中正常生長(zhǎng)超過(guò)50d［32］。

近期的研究證實(shí)CIPK2基因在植物傳遞鈣信號(hào)，應(yīng)答外界刺激的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Chen等［10］發(fā)現(xiàn)玉米ZmCIPK2受鹽、干旱、低溫和高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量在根和葉中存在差異；高鹽、干旱和ABA處理均可增加鹽生植物短芒大麥草（Hordeumbrevisubulatum）HbCIPK2的表達(dá)量，且超表達(dá)HbCIPK2的轉(zhuǎn)基因擬南芥抵抗鹽和滲透脅迫的能力顯著上升［33］；本實(shí)驗(yàn)室從鹽生植物唐古特白刺中克隆獲得NtCIPK2基因，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株對(duì)高鹽、干旱、低溫及高溫的抗性明顯提高（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。上述研究表明CIPK2的表達(dá)可能是植物具有多種抗性的基礎(chǔ)，因此可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的候選基因。

圖6 轉(zhuǎn)化再生植株Fig.6 Obtaining the transformed plants

圖7 再生植株慶大霉素抗性基因檢測(cè)Fig.7 Detection of aacC1gene in regeneration plants

圖8 再生植株目的基因檢測(cè)Fig.8 Detection of NtCIPK2gene in regeneration plants

本研究獲得抗性紫花苜蓿轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)PCR和RT－PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源基因已整合到苜?；蚪M中并過(guò)量表達(dá)，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化植株在各種逆境脅迫條件的表現(xiàn)及其遺傳穩(wěn)定性，培育具有多重抗逆能力的苜蓿品種，促進(jìn)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

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