聶 韡，房海靈，黃麗莉，江香梅

(江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032)

山蠟梅(Chimonanthus nitens Oliv.)為蠟梅科蠟梅屬植物，又名秋蠟梅、毛山茶等，為江西原產(chǎn)植物，具有祛風(fēng)解表、清熱解毒、醒脾化濁之功效，可用于治療上呼吸道感染、肺結(jié)核咯血等［1－2］。近年來，對山蠟梅葉的化學(xué)成分有少量報(bào)道［3－5］，研究表明其活性成分主要為黃酮及生物堿類成分。目前，由山蠟梅葉制成的制劑多以黃酮類成分作為其質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)［6－7］，而對山蠟梅葉藥材并未有關(guān)于其黃酮類成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，本實(shí)驗(yàn)建立了以HPLC法同時(shí)測定蘆丁、槲皮素和山奈酚3種黃酮類成分的方法，并對不同采收時(shí)間的山蠟梅葉的上述3種黃酮類成分的含量動態(tài)變化進(jìn)行了研究分析，為確定山蠟梅葉最佳采收期提供理論依據(jù)，也可作為山蠟梅葉及其制劑的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);紫外檢測器;超聲清洗器(潔康超聲波有限公司);CP214型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)。

蘆丁、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品批號:100080－200707，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品批號100081－200907;山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品批號:110861－200507;均購自江西省藥檢所。甲醇(色譜純，天津大茂公司);娃哈哈純凈水(杭州);其余試劑均為分析純。

山蠟梅葉采自江西婺源，經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院朱培林研究員鑒定為蠟梅科(Calycanthaceae)山蠟梅(Chimonanthus nitens Oliv.)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為sunfire C184.6mm×250mm色譜柱;流動相為甲醇:水(含0.1%甲酸的溶液:0～5 min:30%～35%;5～30 min:35%～40%;30～38 min:40%～60%;38～48 min:60%～75%;48～60 min:75%;檢測波長為360 nm;流速為1mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量10μL。在該條件下，山蠟梅葉藥材及對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品和山蠟梅葉的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatorams of mixed reference substances and leaves of Chimonanthus nitens Oliv.

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取0.005 g蘆丁、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇(色譜純)溶解并定容至10mL，精密量取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL，混勻，制得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣前用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，去雜質(zhì)，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備 稱取山蠟梅葉粉末1 g，精密稱定，加入40倍φ乙醇=70%溶液，50℃超聲提取30 min。提取液放置至室溫，甲醇定容至100mL，搖勻后取上清液，0.45μm微孔濾膜濾過，待用。

1.2.4 樣品的測定 按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀中，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以外標(biāo)法計(jì)算蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確移取對照品混合溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6分別于1mL容量瓶中依次稀釋定容，取上述各溶液10μL進(jìn)樣。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以各自的峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得蘆丁、槲皮素和山奈酚回歸方程，分別為:Y=1×106X－40497，r=0.996;Y=3×106X－197608，r=0.9997;Y=4×106X－332890，r=0.9992。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮素和山奈酚分別為0.092～1.1 μg，0.088～1.06 μg，0.093～1.113 μg，線性關(guān)系良好。

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測得蘆丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分別為1.01%，0.78%，0.94%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，測得蘆丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分別為1.23%，1.58%，1.46%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0、6、12、18、24h測定，記錄峰面積，測得蘆丁、槲皮素和山奈酚含量的RSD分別為1.82%，2.03%，1.69%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的山蠟梅葉5份，每份為1 g，分別精密加入混合對照品溶液，吹干。然后按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制得待測溶液，按“1.2.1”，項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率。經(jīng)計(jì)算，蘆丁、槲皮素、山奈酚的平均加樣回收率依次分別為98.64%、101.33%、97.89%，RSD值均小于2%，表明分析方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 不同采收時(shí)間山蠟梅葉中黃酮類成分含量測定結(jié)果Tab.1 Contents of flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens Oliv.in different harvesting time

2.6 山蠟梅黃酮類成分含量動態(tài)變化

本試驗(yàn)采用HPLC法測定了不同采收時(shí)間的山蠟梅葉中3種黃酮類成分的含量，分別收集5月、6月、7月、8月、9月、10月的山蠟梅葉，測定其中蘆丁、槲皮素和山奈酚3種黃酮類成分的含量(表1、圖2)。數(shù)據(jù)顯示，山蠟梅葉中上述3種黃酮類成分從5月份開始顯著累積，推斷可能首先生成黃酮苷元類成分槲皮素和山奈酚，經(jīng)由黃酮苷元類成分繼續(xù)合成黃酮苷類成分蘆丁。槲皮素和山奈酚為兩種黃酮苷元類化合物，在早期含量較高，5月份，蘆丁、槲皮素、山奈酚三者含量接近，隨著黃酮的生物合成途徑繼續(xù)進(jìn)行，黃酮苷元類成分槲皮素、山奈酚增長至7月達(dá)到最高值，而后開始呈現(xiàn)下降趨勢，分析原因?yàn)閺?月開始，葉片趨于成熟，黃酮苷元停止合成，已生成的黃酮苷元類成分作為中間體繼續(xù)生成黃酮苷類成分蘆丁等，因此含量從7月份開始逐漸下降。黃酮苷類成分從5月開始呈現(xiàn)穩(wěn)步上升，尤其在8月至10月期間，山蠟梅植株的營養(yǎng)成分已累積充分，黃酮苷類成分累積速度尤為明顯。黃酮類成分總含量從5月份開始到7月份呈現(xiàn)逐漸遞增趨勢，7至8月份由于植株的營養(yǎng)成分在該期間大量累積，造成黃酮類成分合成速率略有降低，從8月至10月黃酮類成分繼續(xù)加速增長。因此，從山蠟梅黃酮類成分累積的動態(tài)變化分析，為保證山蠟梅葉中各種黃酮類成分都較多，同時(shí)考慮藥材產(chǎn)量的因素，選擇8至9月份作為山蠟梅葉的最佳采收期較適宜。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

通過對提取方法(熱回流提取法、冷浸提取法、微波提取法、超聲提取法)的考察，發(fā)現(xiàn)超聲提取法的提取效率較高，且雜質(zhì)少，故采用超聲提取法。在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)L9(34)對超聲提取法的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，考察了料液比、提取時(shí)間和提取溫度3因素的3個(gè)水平，測定結(jié)果表明，最佳提取方案為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用40倍φ乙醇=70%溶液于50℃超聲提取30 min，可以使4種黃酮類成分均達(dá)到較高的提取效率。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3種被測成分均屬于黃酮類結(jié)構(gòu)骨架，紫外掃描發(fā)現(xiàn)其紫外吸收帶I在360 nm處有較大吸收，因此，選擇檢測波長360 nm進(jìn)行測定。另外，在確定流動相系統(tǒng)時(shí)，分別比較了不同梯度的甲醇－水、乙腈－水、甲醇－甲酸水溶液、甲醇－磷酸水溶液、甲醇－三氟乙酸溶液等多個(gè)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，經(jīng)多次試驗(yàn)，最終確定了以甲醇－0.1%甲酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，可使各待測組分得到很好的基線分離且0.1%的甲酸可有效地防止色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

3.3 以往文獻(xiàn)報(bào)道

測定山蠟梅葉中黃酮類成分的HPLC方法控制指標(biāo)較少，多以槲皮素為指標(biāo)［8］，不能較全面地評價(jià)山蠟梅葉及其制劑的質(zhì)量。本試驗(yàn)建立的HPLC法可同時(shí)測定山蠟梅葉中的3種主要黃酮類成分，且具有分離度高、測定準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以更加全面地控制和評價(jià)山蠟梅葉及其制劑的質(zhì)量。

圖2 不同采收時(shí)間山蠟梅葉中黃酮類成分含量變化Fig.2 Dynamic changes of flavonoids in leaves of Chimonanthus nitens in different harvesting time

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