謝安強(qiáng)，洪 偉，吳承禎，李 鍵，林 晗

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 森林生態(tài)研究所，福建 福州 350002;2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

鋁是地殼中含量最豐富的金屬(約占7%)，是繼氧(O)和硅(Si)之后的第三大元素。近年來由于酸雨污染的加劇，許多作物發(fā)生了鋁毒害。我國酸雨覆蓋面積已經(jīng)超過國土面積的30%，土壤中的鋁被逐漸的釋放出來，嚴(yán)重危害了林木和作物的產(chǎn)量和質(zhì)量［1－2］。

桉樹在我國南方大量種植，由于南方土壤受到酸雨的影響比較嚴(yán)重，土壤中的鋁毒逐漸呈現(xiàn)［3－4］國外一些學(xué)者對桉樹在酸鋁環(huán)境中的影響，進(jìn)行了一定程度的研究［5－7］，但對桉樹接種內(nèi)生真菌后鋁脅迫生理特性的變化研究未見報道。

本文將10株內(nèi)生真菌接入桉樹無性系，研究其在不同鋁脅迫條件下植株過氧化物酶、丙二醛和游離脯氨酸含量的變化，為篩選出優(yōu)良抗鋁菌種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)所用材料為福建省林科院組培中心的尾巨桉3229號無性系組培苗。根據(jù)試驗(yàn)需要選擇營養(yǎng)條件良好且生長一致的苗木。由于營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)可以控制植物生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，該方法被應(yīng)用于植物營養(yǎng)科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。營養(yǎng)液采用Hoagland不完全營養(yǎng)液配方［8］，鋁脅迫試驗(yàn)設(shè)置3個鋁離子處理水平，分別為0，50，100μm，在每個溶液中加入等量的CaCl2［9］。

水培試驗(yàn)容器采用直徑為20 cm、體積3 L的塑料小桶，使用前將塑料桶用黑色油漆涂成黑色，漆2～3層，確保四面不透光(模擬土壤環(huán)境)。將塑料桶清洗干凈，在桶蓋上打3個小孔，并將桶的邊緣剪開，以便于苗木的放入。桶蓋中央打1個大孔，用于放入通氣管道。苗木放入塑料桶前，用蒸餾水清洗干凈根部，并吸干水分。裝桶前測量苗木株高、地徑，盡量使植株保持大小均衡。每桶定植3株。定植后利用氧氣泵每天07:00、15:00、23:00給苗木通氣30 min，每隔3 d更換1次培養(yǎng)液。

在初始培養(yǎng)10 d后，為避免鋁離子與營養(yǎng)液中的磷酸鹽形成沉淀物，根據(jù)謝國生等［10］方法修改后進(jìn)行Al間隔處理:將植物根系生長于含100μm AlCl3的0.5mm CaCl2溶液(pH 4.5)和50μm AlCl3的0.5mm CaCl2溶液(pH 4.5)中，處理1 d。與此同時，對照根系置于0.5mm CaCl2溶液(pH 4.5)中第2 d將Al處理和對照的根系置于Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)1 d，然后再進(jìn)行Al和對照處理。如此交叉處理10 d后，測量各項(xiàng)生理生化指標(biāo):過氧化物酶(SOD)含量、丙二醛含量測定、游離脯氨酸含量。

1.2 接種試驗(yàn)

將10個菌種(表1)接入等體積的液體培養(yǎng)基，經(jīng)過24h的培養(yǎng)，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度將菌液用水溶液稀釋成5.0×106cfu/mL。將幼苗清洗干凈，并用蒸餾水沖洗3次。然后將幼苗根系浸泡在相同濃度的菌液當(dāng)中，放置30 min，用蒸餾水清洗3次，最后將幼苗轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中。

表1 10株菌株Tab.1 Ten kinds of fungus

1.3 測定方法

過氧化物酶、丙二醛和游離脯氨酸含量測定均參照李合生的方法［29］。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌對桉樹鋁脅迫下過氧化物酶含量的影響

研究表明鋁可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的H2O2、O2－、－OH等活性氧，從而使核酸、膜脂和蛋白質(zhì)等生物分子過氧化而受到傷害，破壞細(xì)胞的代謝活動［11－12］。目前雖然植物對鋁毒的忍耐機(jī)制還不是很清楚，但很多研究表明，鋁對植物的最初表現(xiàn)都是體現(xiàn)在細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜的過氧化程度與植株的鋁抵抗力密切相關(guān)［13－14］。另一方面，當(dāng)植株受到鋁毒害時，植物體內(nèi)將產(chǎn)生一些抗氧化酶(如過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶)和非酶類物質(zhì)(如脯氨酸和抗壞血酸等)［15－16］。由此可見，植物對鋁脅迫的耐性與它們的抗氧化能力密切相關(guān)，通過研究植株在鋁脅迫過程中抗氧化物酶和非酶類物質(zhì)含量的變化可以揭示植株對鋁脅迫的耐受力［11］。

隨著低鋁脅迫的加深，桉樹植株過氧化物酶的含量呈現(xiàn)上升或者先上升后下降的趨勢(圖1)。對不同脅迫處理的過氧化物酶含量進(jìn)行方差分析表明(表2)，不同菌種處理間達(dá)到極顯著差異水平，不同鋁脅迫處理間未達(dá)到顯著差異水平。與對照相比，處理A、D、E達(dá)到顯著水平。與對照處理相比，鋁脅迫處理1和鋁脅迫處理2之間未達(dá)到顯著差異水平。對不同脅迫處理過氧化物酶含量進(jìn)行LSD多重比較分析表明(表3)，與對照處理CK相比較，處理D、A、E、C、F、H、B和G的過氧化物酶含量分別增加53.11%、38.80%、37.97%29.05%、25.73%、21.37%、16.18%和7.88%，處理J和I的過氧化物酶含量分別減少7.47%和5.60%這表明植株隨著鋁脅迫的加強(qiáng)，過氧化物酶含量呈現(xiàn)上升的趨勢，植株體內(nèi)的自我保護(hù)系統(tǒng)啟動，過氧化酶起著清除體內(nèi)過多氧化自由基的作用，保護(hù)細(xì)胞膜不受傷害。不同菌種處理的植株過氧化酶含量呈現(xiàn)明顯差異性。大部分植株與對照相比過氧化酶含量明顯增加，其中菌種D和A增加十分顯著，這表明內(nèi)生菌接種對提高植株抗鋁脅迫起到了一定作用。

圖1 11種桉樹處理的過氧化物酶活性變化Fig.1 The diagrams of POD activity in eleven treatments

表2 11種處理和不同Al脅迫處理過氧化物酶含量的方差分析Tab.2 The variance analysis of different Al treatments POD activity in eleven treatments

2.2 內(nèi)生真菌對桉樹鋁脅迫下丙二醛含量的影響

隨著低鋁脅迫的加深，植株丙二醛的含量呈現(xiàn)上升的趨勢(圖2)。對不同脅迫處理的丙二醛含量進(jìn)行方差分析(表4)，不同菌種處理和不同鋁脅迫處理間均達(dá)到極顯著差異水平。對不同脅迫處理的丙二醛含量進(jìn)行LSD多重比較分析(表5)，與對照相比，A、D、E達(dá)到極顯著水平。與對照處理相比，鋁脅迫處理1達(dá)到顯著水平，鋁脅迫處理2達(dá)到極顯著水平。與對照處理CK相比較，處理A、D、E、B、C I、H和G的丙二醛含量分別減少50.33%、48.33%、44.54%、16.93%、11.80%、8.46%、5.12%和4.23%，處理F和J的丙二醛含量分別增加8.46%和3.56%。這表明植株由于受到鋁毒害的作用，丙二醛含量增加，對細(xì)胞膜系統(tǒng)形成了一定程度的傷害。但由于接種內(nèi)生真菌，大部分植株一定程度減弱了丙二醛的傷害，起到保護(hù)植株的作用。

可見，在鋁脅迫下，一方面由于鋁離子刺激植物產(chǎn)生更多的自由基，使膜脂過氧化，導(dǎo)致體內(nèi)MDA含量的增加;另一方面，刺激了植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)反應(yīng)，使保護(hù)酶活性增強(qiáng)，加快清除過多的自由基，減輕膜脂過氧化程度，降低了體內(nèi)的MDA含量。當(dāng)這兩個方面達(dá)到一個平衡狀態(tài)，植物不體現(xiàn)出傷害癥狀。當(dāng)平衡被打破，植物各項(xiàng)生理指標(biāo)開始產(chǎn)生劇烈的變化。由此可見，植株在鋁脅迫下的生理反應(yīng)是一個系統(tǒng)的反應(yīng)，他們互相協(xié)調(diào)，共同保護(hù)植物不受活性氧的傷害。

2.3 內(nèi)生真菌對桉樹鋁脅迫下游離脯氨酸含量的影響

脯氨酸(Pro)作為一種有機(jī)溶劑，廣泛存在于植株體內(nèi)。脯氨酸一般被看作細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)游離氨基酸可以增加細(xì)胞液的濃度，對原生質(zhì)形成保護(hù)作用。游離脯氨酸也能促進(jìn)蛋白質(zhì)的水合作用，使蛋白質(zhì)膠體的親水面積增大，能使可溶性蛋白質(zhì)含量增多。它起到能維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、滲透調(diào)節(jié)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋?7］作用。它的增加有助于細(xì)胞或組織的保水，同時還可作為碳水化合物的來源，酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保護(hù)劑，可以防止活性氧對膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化作用［18］。湯章城［19］研究認(rèn)為脯氨酸主要有兩個來源，一是鳥氨酸，二是谷氨酸。逆境脅迫使脯氨酸增加的原因主要因?yàn)?氧化受抑、合成受刺激和蛋白質(zhì)合成受阻，而植物體內(nèi)脯氨酸的用處主要有參與蛋白質(zhì)合成或被氧化。王韶唐［20］認(rèn)為脯氨酸在積累后又有下降的趨勢，因?yàn)槊{迫條件下脯氨酸的合成來源于谷氨酸，需要利用碳水化合物的不斷供應(yīng)來維持脯氨酸更新。

表3 11種處理過氧化物酶含量的LSD多重比較分析Tab.3 The multiple comparison analysis of POD activity in eleven treatments

表4 11種處理和不同Al脅迫處理丙二醛含量的方差分析表Tab.4 The variance analysis of different Al treatments MDA content in eleven treatments

隨著低鋁脅迫的加深，植株游離脯氨酸的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3)。對不同脅迫處理的游離脯氨酸含量進(jìn)行方差分析(表6)，不同菌種處理和不同鋁脅迫處理間均達(dá)到極顯著差異水平對不同脅迫處理的游離脯氨酸含量進(jìn)行LSD多重比較分析(表7)，與對照相比，處理A、E、J達(dá)到顯著差異水平，處理D達(dá)到極顯著差異水平。與對照處理相比，鋁脅迫處理1和鋁脅迫處理2均達(dá)到極顯著差異水平。與對照處理CK相比較，處理D、A、E、I、C、G和B的游離脯氨酸含量增加50.84%、35.75%32.96%、18.44%、13.97%、3.91%和1.12%，處理J、F和H的游離脯氨酸含量減少28.49%、17.32%和2.79%。這表明由于受到鋁毒的傷害，植株的自我修復(fù)機(jī)制啟動，脯氨酸含量一定程度增加，起到保護(hù)植株的作用。不同菌種處理的植株脯氨酸含量具有明顯的區(qū)別，這表明不同菌種處理的植株內(nèi)在生理生化特性產(chǎn)生了一定程度的變化，在一定程度提高了植株的抗性。

表5 11種處理和不同Al脅迫處理丙二醛含量的LSD多重比較分析Tab.5 The multiple comparison analysis of different Al treatments MDA content in eleven treatments

圖2 11種桉樹處理的丙二醛含量變化Fig.2 The diagrams of MDA content in eleven treatments

圖3 11種桉樹處理的游離脯氨酸含量變化Fig.3 The diagrams of PRO content in eleven treatments

表6 11種桉樹處理不同Al脅迫處理游離脯氨酸含量的方差分析Tab.6 The variance analysis of different Al treatments PRO content in eleven treatments

表7 11種處理和不同Al脅迫處理游離脯氨酸含量的LSD多重比較分析Tab.7 The multiple comparison analysis of different Al treatments PRO content in eleven treatments

3 結(jié)論和討論

許多研究表明，雖然鋁不是植物生長的必需元素，過量的鋁會對植株產(chǎn)生毒害作用，但微量的鋁可能有利于植株的生長［21－24］。關(guān)于低鋁促進(jìn)植株生長的機(jī)理尚不明了，有人認(rèn)為低鋁濃度可能會維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞的外滲物而對植株的生長有利［16］，但當(dāng)鋁離子濃度達(dá)到一定數(shù)值時，鋁才會對植株產(chǎn)生毒害作用。

Ma等［25］認(rèn)為，在鋁脅迫條件下，根尖分泌有機(jī)酸，同時在根尖積累了大量的鋁離子，鋁離子和有機(jī)酸鰲合。其鰲合物對植物細(xì)胞沒有毒性，難分解，并且很難進(jìn)入細(xì)胞。因此，植物植株表現(xiàn)出耐鋁能力Mark等［26］的研究發(fā)現(xiàn)，外生菌根真菌在田間栽植條件下可以提高苗木在高鋁脅迫條件下的存活率，即使在鈣離子濃度比較低的條件下也能適應(yīng)。Stamford等［27］的研究指出，菌根真菌在酸性土壤中可以降低植株的鋁毒害，并且不需要加入石灰。這些都表明菌根真菌可以在一定程度上緩和鋁的毒害。在接種菌根真菌制劑時，該種真菌必須在高鋁脅迫條件下具有較高的生長速度和感染能力，才能快速而有效地緩解鋁的毒性，使植物的根系保持正常生長速率［28］。本文的試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Stamford的觀點(diǎn)是正確的。

由于參與鋁轉(zhuǎn)導(dǎo)的因素很多，但關(guān)于信號分子之間或信號分子與有機(jī)酸陰離子通道相互作用的研究比較少，因此以后可以加強(qiáng)這方面的研究。研究菌株的分泌物，研究其是否分泌有機(jī)酸。研究植株在單獨(dú)鋁脅迫條件下和接種內(nèi)生真菌鋁脅迫下蛋白質(zhì)表達(dá)差異，研究其是否在內(nèi)生菌的誘導(dǎo)下某些基因加強(qiáng)表達(dá)，研究內(nèi)生菌是否促進(jìn)了植株抗鋁基因的表達(dá)。研究所接種的內(nèi)生真菌在正常條件下的分泌物與在鋁脅迫條件下的分泌物，研究鋁離子是否對真菌的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。還可以將它們分別與植株進(jìn)行接種，分析接種對植株產(chǎn)生的影響。

接種菌種A、D、E后植株各方面生理指標(biāo)均體現(xiàn)出一定程度的抵御鋁毒害的能力。今后可以考慮進(jìn)一步研究菌株抵御鋁毒能力的機(jī)理，以便將其推廣應(yīng)用于現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中。

［1］趙志剛，丁貴杰，唐敏.酸、鋁脅迫對馬尾松種子萌發(fā)與芽苗生長的影響［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2007，20(1):111－115.

［2］閆明，鐘章成.鋁脅迫和叢枝菌根真菌對樟樹幼苗生長的影響［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，29(4):161－165.

［3］Arbestain M C，Mourenza C，Alvarez E，et al.Influence of parent material and soil type on the root chemistry of forest species grown on acid soils［J］.For Ecol Manag，2004，193(3):307 －320.

［4］Alrarez E，F(xiàn)emandez－ Marcos M L，Monterroso C，et al.Application of aluminums toxicity indices to soils under various forest species［J］.For Ecol Manag，2005，211(3):227 －239.

［5］Neves J C L，Novais R F，Barros N F.Effect of aluminium in nutrient solution on growth and nutrient uptake by Eucalyptus spp［J］.Rev Arvor，1982，6:1 －16.

［6］Silva I R，Novais R F，Jham G N，et al.Responses of eucalypt species to aluminum:the possible involvement of low molecular weight organic acids in the Al tolerance mechanism［J］.Tree Physiology，2004，24:1267 － 1277.

［7］Tahara K，Norisada M，Yamanoshita T，et al.Role of aluminium －binding ligands in aluminium resistance of Eucalyptus camaldulensis and Melaleuca cajuputi［J］.Plant Soil，2008，302:175 － 187.

［8］楊曾獎.桉苗水培營養(yǎng)配方和pH值的選擇［J］.林業(yè)科學(xué)研究，1990，3(5):495－498.

［9］方允中，楊勝，伍國耀.自由基穩(wěn)衡性動態(tài)［J］.生理科學(xué)研究進(jìn)展，2004，35(3):1999－2004.

［10］謝國生，師瑞紅，龐貞武，等.鋁脅迫下水稻幼苗根系的生理特性［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20(7):1698－1704.

［11］Guo Tian-rong，Zhang Guo-ping，Zhou Mei-xue，et al.Effects of aluminum and cadmium toxicity on growth and antioxidant enzyme activities of two barley genotypes with different Al resistance［J］.Plant and Soil，2004，258:241 －248.

［12］Yang J L，Zheng S J，He Y F，et al.Aluminium resistance requires resistance to acid stress:a case study with spinach that exudes oxalate rapidly when exposed to Al stress［J］.Journal of Experimental Botany，2005，56:1197 －1203.

［13］Yamamoto Y，Kobayashi Y，Matsumoto H.Lipid peroxidation is an early symptom triggered by aluminum，but not the primary cause of elongation inhibition in pea roots［J］.Plant Physiology，2001，125:199 －208.

［14］Ahn S J，Rgngel Z，Matsumoto H.Aluminum －induced plasma membrane surface potential and H －ATPase activity in near isogenic wheat fines differing in tolerance to aluminium［J］.New Phytologist，2004，62:71 －79.

［15］Ciamporova M.Morphological and structural responses of plant roots to aluminium at organ，tissue and cellular levels［J］.Biology Plant，2002，45:161 －171.

［16］Devi S R，Yamamoto Y，Matsumoto H.An intracellular mechanism of aluminum tolerance associated with high antioxidant status in culture tobacco cells［J］.Journal of Inorganic Biochemistry，2003，97:59 －68.

［17］劉祖祺，張石城.植物抗性生理學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1994:44－45.

［18］王翼川，李志軍，徐雅麗.低溫脅迫對海島棉幼苗生理生化特性的影響［J］.中國棉花，2001，22(5):13－14.

［19］湯章誠.不同抗旱品種高粱苗中脯氨酸積累的差異［J］.植物生理學(xué)報，1986，12(2):154.

［20］王韶唐.植物抗旱的生理機(jī)理［J］.植物生理生化進(jìn)展，1983(2):124－126.

［21］Liu P，Xu G D，Jiang X M，et al.The effect of aluminum oil germination of soybean seed［J］.Seed，2003，(1):30 －32.

［22］Liu P，Xu G D，Jiang X M，et al.The effect of aluminum on membrane lipid peroxidation and endogenous protective systems of soybean［J］.Agricultural Environment Science Sinica，2004，23:51 －54.

［23］Ying X F，Liu P.Effects of aluminium stress on photosynthetic characters of soybean［J］.Chinese Journal of Applied Ecology，2005，16:166 －170.

［24］Kid P S，Proctor J.Effects of aluminium on the growth and mineral composition of Betula pendula Roth［J］.Journal of Experimental Botany，2000，51:1057 －1066.

［25］Ma J F，Hiradate S，Nomoto K，et al.Internal detoxification mechanism of Al in Hydrangea:Identification of Al for in the leaves［J］.Plant Physiol，1997，113:1033 －1039.

［26］Mark H R，Thomas C H.The effects of aluminum and calcium on the growth and nutrition of selected ectomycorrhizal fungi of jack pine［J］.Can J Bot，1991，69:1691 －1699.

［27］Stamford N P，Silvia R A.Effect of lime and inoculation of Mimosa caesalpiniaefolia in acid soil of the forest zone and semiarid region of pernambuco［J］.Pesquisa Agropecudria Brasileira，2000，35(5):1037 －1045.

［28］Kasuya M C M，Muchovej R M C，Muchovej J J.Influence of aluminum on in vitro formation of Pinus caribaea mycorrhizae［J］.Plant and Soil，1990，124:73 －77.

［29］李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2002:415－419.