陳蒙蒙，黑飛龍，吳 蓓，王世磊，秦春妮，楊勝男，王 晨，龍 村

非去極化心臟停搏液短時(shí)常溫保存對(duì)豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

陳蒙蒙，黑飛龍，吳 蓓，王世磊，秦春妮，楊勝男，王 晨，龍 村

目的探討短時(shí)常溫（1 h，37℃）條件下，非去極化心臟停搏液（NDP）對(duì)豬冠脈內(nèi)皮源性超極化因子（EDHF）介導(dǎo)的血管舒張功能的影響。方法 根據(jù)保存液的不同，將血管環(huán)分成四組，分別為對(duì)照（CON）組、St.Thomas（ST）組、HTK組、NDP組。采用器官槽法，將血管環(huán)分別置于Krebs-Hensleit（KH）液、ST液、HTK液、NDP液中，37℃條件下保存1 h，加入一氧化氮合酶阻滯劑N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）和環(huán)加氧酶阻滯劑（Indomethacin），記錄由前列腺素F2α（U46619）及緩激肽（Bradykinin）引起的血管收縮和舒張反應(yīng)。結(jié)果 NDP組中EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張百分比最大，為（74.79±6.40）％，其余依次為HTK組（51.32±21.92）％、CON組（24.03±8.01）％、ST組（16.20±6.39）％。結(jié)論 短時(shí)常溫（1 h，37℃）條件下，NDP液對(duì)冠脈內(nèi)皮的舒張功能具有保護(hù)作用，且優(yōu)于HTK組、CON組和ST組。

血管環(huán)；保存液；內(nèi)皮源性超極化因子

在冠脈循環(huán)系統(tǒng)中，內(nèi)皮具有多種生理功能，尤其在調(diào)節(jié)血管張力方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1]。內(nèi)皮主要通過(guò)釋放內(nèi)皮源性舒張因子調(diào)節(jié)血管張力，包括一氧化氮（nitric oxide，NO），前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）和內(nèi)皮源性超極化因子（endotheliumderived hyperpolarizing factor，EDHF）[2]。研究發(fā)現(xiàn)臨床廣泛應(yīng)用的高鉀去極化停搏液嚴(yán)重?fù)p害血管內(nèi)皮的舒張功能，主要影響EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能[3]。為了改善冠脈血管內(nèi)皮的保護(hù)效果，課題組對(duì)原有停搏液進(jìn)行改進(jìn)，引入了“靜息停搏”和“血管保護(hù)”的理念，設(shè)計(jì)出一種新型的“非去極化心臟停搏液（non-depolarizing solution，NDP）”。本研究應(yīng)用一氧化氮合酶阻斷劑L-NNA和環(huán)加氧酶阻斷劑Indomethacin分別阻斷NO和PGI2的作用，旨在探討短時(shí)常溫（1 h，37℃）保存條件下，NDP液對(duì)豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮EDHF介導(dǎo)的舒張功能的保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 PowerLab八通道高速記錄主機(jī)（澳大利亞ADInstruments公司），橋式放大器（澳大利亞ADInstruments公司），離體組織灌流裝置（澳大利亞ADInstruments公司），高精度張力傳感器（澳大利亞ADInstruments公司），恒溫循環(huán)水浴（英國(guó)TECHNE公司）。

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 一氧化氮合酶阻斷劑N-硝基-L-精氨酸（L-NNA，美國(guó)sigma公司），環(huán)加氧酶阻斷劑吲哚美辛（Indomethacin，美國(guó)sigma公司），前列腺素F2α（U46619，美國(guó)Cayman公司），緩激肽（Bradykinin，美國(guó)sigma公司）。

1.3 溶液配制 Krebs-Hensleit（KH）液（mmol/L）：NaCl 118.5，KCl 4.75，MgSO41.19，KH2PO41.18，NaHCO325.0，CaCl21.4，葡萄糖11.0，pH 7.4。St.Thomas（ST）液（mmol/L）：NaCl 110，KCl 16，CaCl 1.2，NaHCO325，pH 7.8。Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 9，MgCl2· 6H2O 4，甘露醇30，L-組氨酸180，組氨酸鹽酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸鉀鹽1，pH 7.3。NDP液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 5，MgCl2·6H2O 4，L-組氨酸180，組氨酸鹽酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸1，棉子糖30，谷光甘肽3，腺甘0.2，利多卡因0.5，尼可地爾0.01，pH 7.4。

1.4 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 豬心，600～800 g。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 根據(jù)保存液的不同實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為對(duì)照（CON）組、ST組、HTK組、NDP組。于附近的屠宰場(chǎng)獲取新鮮豬心，置于4℃冷KH液中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。分離冠脈的左前降支，取中下1/3段截取成若干段2.2～2.8 mm，長(zhǎng)度5 mm左右的血管環(huán)。保證每次實(shí)驗(yàn)中，四種不同保存液組的血管環(huán)來(lái)自同一豬心冠脈左前降支，每組樣本量（n＝8）相同。將血管環(huán)懸掛在一對(duì)三角形不銹鋼絲上，置于盛有37℃、經(jīng)95％O2+5％CO2混合氣體飽和的KH液的玻璃浴槽中固定。緩慢調(diào)節(jié)血管環(huán)的靜息張力，使其在2.5 g左右達(dá)到平衡。平衡1 h后，將血管環(huán)分別浸泡于37℃的KH液、ST液、HTK液、NDP液，保存1 h。保存時(shí)間到后，用37℃KH液更換不同保存液，平衡30 min，加入7 μmol/L Indomethacin和300 μmol/L L-NNA，水浴30 min后，加入30 nmol/L U46619收縮血管，20 min左右達(dá)到平臺(tái)，依次加入終濃度為10-10mol/L、10-9.5mol/L、10-9mol/L、10-8.5mol/L、10-8mol/L、10-7.5mol/L、10-7mol/L、10-6.5mol/L、10-6mol/L的Bradykinin舒張血管，每個(gè)濃度點(diǎn)之間的時(shí)間間隔為2 min，在每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定血管張力。

1.6 觀察指標(biāo) 37℃條件下平衡1 h后，各組血管環(huán)靜息張力（g）；各組保存1 h后的血管張力及變化幅度（g）；加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后血管張力的改變（g）；各組加入U(xiǎn)46619后血管的收縮幅度；不同濃度Bradykinin引起的EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張百分比（占U46619收縮幅度的百分比）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。所有計(jì)量數(shù)據(jù)檢驗(yàn)前均經(jīng)方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同的停跳液保存1 h后血管靜息張力的改變 平衡期各組血管環(huán)靜息張力無(wú)顯著差異。37℃保存1 h后，CON組、HTK組靜息張力幾乎沒(méi)有改變，ST組靜息張力有所增加，NDP組靜息張力顯著下降，見(jiàn)圖1。

圖1 各組保存1 h后靜息張力改變

2.2 加入阻斷劑后血管張力的改變 各組加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后血管靜息張力均有所增加，與ST組、HTK組相比，NDP組張力變化幅度明顯減小，見(jiàn)圖2。

圖2 各組加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后靜息張力改變

2.3 加入U(xiǎn)46619收縮血管，記錄最大血管收縮張力 不同的停搏液組中加入收縮劑U46619后，血管環(huán)的張力均明顯增加，但各組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖3。

圖3 各組加入血管收縮劑U46619后血管張力的改變

2.4 Bradykinin介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張作用

在各組不同的停搏液中，依次加入10-10～10-6mol/L濃度的Bradykinin，隨Bradykinin濃度的增大，血管舒張幅度也逐漸增大，其中NDP組中Bradykinin引起的EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張百分比最大，其次分別為HTK組、CON組、ST組，見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度Bradykinin引起的EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張百分比

3 討 論

近年來(lái)很多研究提示傳統(tǒng)的高鉀停搏液會(huì)損害冠脈血管內(nèi)皮的功能[3-5]，而內(nèi)皮的完整性對(duì)維持正常的心功能至關(guān)重要[6-7]，因此，研究不同心臟停搏液對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用非常重要。內(nèi)皮主要釋放三種內(nèi)皮源性舒張因子，包括NO，PGI2和EDHF，EDHF在冠脈血管張力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，尤其是當(dāng)NO和PGI2的作用受損時(shí)，EDHF的作用會(huì)代償性增強(qiáng)，從而維持血管張力的穩(wěn)定。本研究應(yīng)用阻斷劑Indomethacin和L-NNA分別阻斷PGI2和NO的作用，主要探討新型非去極化心臟停搏液，即NDP液對(duì)EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張作用的影響。

不同的心臟保存液成分對(duì)血管的靜息張力會(huì)產(chǎn)生不同的影響。本研究中，血管環(huán)在常溫保存1 h后，CON組和HTK組血管張力變化不大，而ST組血管環(huán)的靜息張力明顯增高，升高幅度為（0.1276± 0.0412）g，NDP組的血管靜息張力明顯下降，下降幅度為（0.3445±0.0884）g。加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA后，發(fā)現(xiàn)各組血管環(huán)靜息張力均有所增加，其中ST組血管張力增加的幅度最大，為（0.2734±0.0914）g，而NDP組血管張力增加的幅度最小，為（0.0987±0.1146）g。以上結(jié)果均提示ST液會(huì)引起冠脈血管的收縮，與Dong等的研究結(jié)果結(jié)果相一致[8]，而NDP液能夠較好地維持血管張力的穩(wěn)定。

不同作用原理的保存液對(duì)血管的收縮和舒張功能的影響也不相同。先使用U46619對(duì)血管環(huán)進(jìn)行收縮，各組血管環(huán)收縮幅度無(wú)顯著性差異。隨后，依次加入不同濃度（10-10～10-6mol/L）Bradykinin。隨著B(niǎo)radykinin濃度的增加，EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張百分比逐漸增大，其中NDP組和HTK組血管舒張百分比明顯升高，而ST組、CON組隨Bradykinin濃度的升高，血管的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)性相對(duì)下降，且ST組低于CON組，提示短時(shí)常溫（1 h，37℃）保存時(shí)，NDP液和HTK液能夠較好地保護(hù)血管的舒張功能，而ST液對(duì)EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能具有損害作用，其中主要是高濃度鉀離子的作用[8]。

本研究的結(jié)果顯示，不同停搏液對(duì)血管靜息張力以及EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響不同，這可能與各種停搏液的成分不同有關(guān)。與CON組、HTK組、NDP組相比，ST組中血管靜息張力明顯增加，EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張作用明顯受損。多項(xiàng)研究證實(shí)傳統(tǒng)高鉀停搏液損害血管內(nèi)皮功能，尤其是損害EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張作用，原因主要體現(xiàn)在如下兩方面[3-5]：首先，EDHF通過(guò)使細(xì)胞膜電位超極化發(fā)揮作用，而高濃度K+使平滑肌細(xì)胞膜電位去極化，抑制了EDHF介導(dǎo)的舒張作用；其次，EDHF通過(guò)開(kāi)放K+通道使平滑肌細(xì)胞膜電位超極化，尤其是Ca2+離子激活的K+通道和ATP敏感性K+通道，而高濃度K+會(huì)對(duì)這些K+通道產(chǎn)生抑制作用。

與CON組、ST組相比，HTK組對(duì)血管靜息張力的影響較小，也能較好地保護(hù)EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張作用。Pizzicannella等[9]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和超微結(jié)構(gòu)分析證明，與生理鹽水相比，HTK液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有更好的保護(hù)效果。HTK液對(duì)血管內(nèi)皮功能有較好的保護(hù)效果，可能與其成分特點(diǎn)相關(guān)[10-11]：K+濃度為9 mmol/L，稍高于K+的生理濃度，對(duì)血管內(nèi)皮的影響較小；細(xì)胞外低鈉可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞水腫，微鈣有利于保護(hù)血管的舒張功能；組氨酸/組氨酸鹽緩沖系統(tǒng)能夠減輕缺血期間的細(xì)胞酸中毒。

NDP液為非去極化型心臟停搏液，K+濃度為5 mmol/L，低于ST液和HTK液，處于K+的生理濃度范圍之內(nèi)。與其它三組相比，NDP組能夠輕微降低血管靜息張力，不引起血管的收縮反應(yīng)，并且其保護(hù)EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的效果最優(yōu)。分析NDP液組成，其血管保護(hù)作用優(yōu)于其它三組的主要原因是：腺苷、利多卡因和尼可地爾可將細(xì)胞膜電位鉗制在靜息電位水平，抑制了電壓依賴性Ca2+通道的開(kāi)放，減少了鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣釋放，從而能夠有效維持血管的靜息張力，保護(hù)血管內(nèi)皮舒張功能。其中，腺苷通過(guò)與腺苷受體結(jié)合激活A(yù)TP敏感性K+通道發(fā)揮心血管保護(hù)作用[12]，Jakobsen等[13]應(yīng)用腺苷取代停搏液中高濃度K+，發(fā)現(xiàn)腺苷能夠保護(hù)EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張作用；Dong等[14]研究證明尼可地爾能夠改善停搏液對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)效果，保護(hù)EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張作用，可能機(jī)制為其開(kāi)放ATP敏感性K+通道，使平滑肌細(xì)胞膜電位超極化，與EDHF的作用協(xié)同，從而保護(hù)了EDHF介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短時(shí)常溫（1 h，37℃）保存后，NDP液具有良好的血管內(nèi)皮保護(hù)效果，其作用明顯優(yōu)于CON組、ST組和HTK組。NDP液可使平滑肌細(xì)胞膜電位超極化，促進(jìn)EDHF的釋放，保護(hù)了EDHF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。此外，組氨酸緩沖系統(tǒng)、抗氧化劑谷胱甘肽、非滲透物質(zhì)棉子糖的加入，進(jìn)一步增強(qiáng)了血管保護(hù)效果。NDP液血管保護(hù)的特點(diǎn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)高鉀停搏液損害血管內(nèi)皮功能的不足，更符合理想心臟停搏液的特點(diǎn)，既滿足了心臟外科手術(shù)的要求，又極大程度地改善了心臟的保護(hù)效果。但目前NDP液的研究還處于基礎(chǔ)研究階段，還需要進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)，從而為NDP液的臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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The protective effect of non-depolarizing solution on the endothelium-related relaxation of porcine coronary arteries under normal temperature

Chen Meng-meng，Hei Fei-long，Wu Bei，Wang Shi-lei，Qin Chun-ni，Yang Sheng-nan，Wang Chen，Long Cun
Department of CPB，State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Disease，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，People＇s Republic of China

Hei Fei-long，Email：heifeilong＠126.com

ObjectiveThe present study was designed to evaluate the protective effect of non-depolarizing solution（NDP）on the endothelium-derived hyperpolarizing factor（EDHF）-mediated relaxation of porcine coronary arteries after rings were incubated with NDP solution at 37℃for 1 hour.MethodsDue to different preservation solutions used in different groups，the rings were divided into four groups：control（CON）group，St.Thomas（ST）group，Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）group and NDP group.Rings from porcine coronary arteries were studied in the organ chamber.After equilibration，the rings were incubated with Krebs-Helenseit solution in CON group，St.Thomas solution in ST group，HTK solution in HTK group，non-depolarizing solution in NDP group at 37℃for 1 hour.Then Pre-contraction tone induced by prostaglandin F2α（U46619）and endothelium-dependent relaxation tone induced by bradykinin was measured in the presence of indomethacin and L-NNA.ResultsAfter incubation with different solutions at 37℃for 1 hour，the EDHF-mediated relaxation induced by bradykinin was much higher in the NDP group 74.79％±6.40％ than in the HTK group 51.32％±21.92％，CON group 24.03％±8.01％and ST group 16.20％±6.39％.ConclusionNDP solution provides superior endothelium protective effect compared with ST and HTK solution under normal temperature.

Vascular rings；Preservation solutions；Endothelium-derived hyperpolarizing factor

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0252-05

2013-08-01）

2013-08-29）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972866）

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7102131）

100037北京，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，國(guó)家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院，心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，體外循環(huán)科

黑飛龍，Email：heifeilong＠126.com