江 淦，徐志偉

·臨床研究·

不同的體外循環(huán)溫度和方法對嬰兒外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)的影響

江 淦，徐志偉

目的研究淺低溫（MH）、深低溫停循環(huán)（DHCA）和深低溫停循環(huán)加選擇性腦灌注（DHCA+SCP）三種轉(zhuǎn)流方法對先天性心臟病嬰兒外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)變化的影響。方法33例先天性心臟病手術(shù)患者分為：10例MH組，10例DHCA組和13例DHCA+SCP組。分別于轉(zhuǎn)流前（T0）、轉(zhuǎn)流結(jié)束后12～24 h（T1）、轉(zhuǎn)流結(jié)束后4～5 d（T2）測定外周動(dòng)脈血中CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量變化。結(jié)果T0：MH組、DHCA組和DHCA+SCP組患者外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量無顯著差異（P＞0.05）；T1：DHCA組CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量顯著高于MH組和DHCA+SCP組（P＜0.01）；T2：DHCA組CD34+/ckit+干細(xì)胞含量也顯著高于MH組以及DHCA+SCP組（P＜0.01）。結(jié)論DHCA方法與MH和DHCA+SCP方法相比會導(dǎo)致外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)的升高，可能存在不同程度骨髓向外周血?jiǎng)訂T修復(fù)，為提高臨床治療效果提供新思路。

淺低溫；深低溫停循環(huán)；選擇性腦灌注技術(shù)；外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞；嬰兒

隨著外科手術(shù)和體外循環(huán)以及術(shù)后監(jiān)護(hù)技術(shù)的進(jìn)步，小兒心外科手術(shù)的預(yù)后得到明顯改善。但是嬰幼兒心內(nèi)直視手術(shù)后的重要臟器并發(fā)癥的發(fā)生率仍然較高，如：神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙發(fā)生率高達(dá)10%～ 25%、以及肺、腎、全身炎癥反應(yīng)等［1-5］。深低溫停循環(huán)（deep hypothermia circulatory arrest，DHCA）加選擇性腦灌注（selective cerebral perfusion，SCP）由于手術(shù)視野無血、操作方便是目前修補(bǔ)復(fù)雜先天性心臟畸形的常用體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）方法。雖然證實(shí)在低溫下對神經(jīng)系統(tǒng)等器官有保護(hù)效果，但一定時(shí)程的血流阻斷（如DHCA），仍然會引起腦缺血損傷［6-7］。

由于手術(shù)損傷造成的缺血、炎癥等會引起骨髓內(nèi)C-kit+細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答向外周血?jiǎng)訂T［8-9］，且大量研究表明骨髓動(dòng)員的內(nèi)皮祖細(xì)胞對各器官的損傷及缺血的修復(fù)過程也有密切聯(lián)系［10-12］。因此，本研究旨在通過比較淺低溫（mild hypothermia，MH）、DHCA和DHCA+SCP三種不同轉(zhuǎn)流方法對嬰兒外周血內(nèi)CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)水平的影響，比較三種轉(zhuǎn)流術(shù)后的先心病嬰兒是否存在不同程度的骨髓向外周血?jiǎng)訂T修復(fù)的可能性，為將來提高臨床治療效果提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 33例先天性心臟病嬰幼兒，男20例，女13例。年齡1～16個(gè)月，體重3～12 kg。分為MH組10例，DHCA組10例和DHCA+SCP組13例，（見表1）。本研究符合本院人體試驗(yàn)倫理委員會制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有入選病例均取得家屬的知情同意。

表1 各組患兒的年齡、體重與ECC時(shí)間（±s）

表1 各組患兒的年齡、體重與ECC時(shí)間（±s）

1.2 麻醉及ECC方法 均采用靜吸復(fù)合麻醉，經(jīng)口氣管插管。ECC預(yù)充液由勃脈力A、5%碳酸氫鈉、10%葡糖糖酸鈣、速尿、20%甘露醇、紅細(xì)胞懸液、20%人血白蛋白、甲潑尼龍、肝素、抗生素等組成。MH組以100 ml/（kg·min）的灌注流量，淺低溫（34℃）轉(zhuǎn)流后復(fù)溫；DHCA及DHCA+SCP組的ECC降溫采用體表及快速轉(zhuǎn)流降溫技術(shù)，通過調(diào)節(jié)流量與水溫控制降溫速度，降至肛溫18～20℃，鼓膜溫16～18℃，DHCA組停止ECC；DHCA+SCP組將主動(dòng)脈插管移至無名動(dòng)脈內(nèi)，灌注流量15～20 ml/（kg·min），主動(dòng)脈手術(shù)修補(bǔ)結(jié)束后將插管退回主動(dòng)脈，復(fù)溫排氣后恢復(fù)ECC。血?dú)夤芾矸绞讲捎忙?穩(wěn)態(tài)及pH穩(wěn)態(tài)相結(jié)合的方式，轉(zhuǎn)流結(jié)束后三組均作改良超濾。

1.3 樣本采集和測定 分別于ECC前（T0），ECC結(jié)束后12～24 h（T1），ECC結(jié)束后4～5 d（T2）三個(gè)時(shí)相點(diǎn)抽取外周動(dòng)脈血行流式細(xì)胞儀（Beckman公司）計(jì)數(shù)檢測。CD34-PE、CD117-APC抗體及溶血素（Beckman公司）。取試管2支分別加入500 μl外周血樣本，各加1支溶血素10 ml，充分混勻，室溫放置15～20 min，至懸液澄清，400 g離心3～5 min，棄上清，加入PBSA 2 ml混勻，400 g離心3～5 min，洗滌一次。棄上清，分別加入PBS 100 μl重懸細(xì)胞備用。在上述兩份已裂紅處理樣本中加入同型對照抗體及CD34、CD117抗體，充分混勻后室溫避光孵育20 min，反應(yīng)結(jié)束后各加入2 ml PBSA混勻，400 g離心3～5 min，洗滌一次。棄上清，加入適量PBSA混勻后上機(jī)檢測，先利用同型對照管調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀的電壓條件，再進(jìn)行測試管的檢測［13］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 T0 MH組，DHCA組和DHCA+SCP組患者的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量分別為（1.71 ±0.10）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞、（1.94±0.23）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞和（1.79±0.12）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞。結(jié)果表明三組患者外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量無顯著差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 T0外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量

2.2 T1 MH組，DHCA組和DHCA+SCP組患者的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量分別為（1.51±0.31）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞、（2.20±0.36）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞和（1.45±0.14）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞。結(jié)果表明DHCA組CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量較MH組以及DHCA+SCP組顯著升高（P＜0.01），見圖2。

2.3 T2 MH組，DHCA組和DHCA+SCP組患者的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量分別為（0.55±0.25）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞、（3.46±1.10）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞和（0.63±0.28）個(gè)/1 000個(gè)裂紅細(xì)胞。結(jié)果表明DHCA組CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量較MH組以及DHCA+SCP組升高更為顯著（P＜0.01）。見圖3。

圖2 T1外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量

圖3 T2外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量

3 討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道低溫對CD34及C-kit干細(xì)胞表達(dá)可能產(chǎn)生一定影響，深低溫環(huán)境下CD34干細(xì)胞會有一定程度的活性及動(dòng)員［14-15］，但有關(guān)低溫對CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量影響的臨床意義及其機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)DHCA組患者手術(shù)后5天內(nèi)的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量持續(xù)高表達(dá)，但是DHCA+SCP組患者的外周血CD34+/c-kit +干細(xì)胞含量則明顯得到抑制，且與MH組相仿。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)MH組與DHCA+SCP組患者的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)含量無論在T0、T1、T2均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)變化（P＞0.05），而DHCA組患者的外周血CD34+/c-kit+干細(xì)胞表達(dá)含量在這三個(gè)時(shí)相都顯著升高。從低溫的角度看，不同程度的低溫對骨髓動(dòng)員向外周血干細(xì)胞的水平可能存在不同程度的調(diào)節(jié)作用。另一方面，選擇性灌注造成的內(nèi)環(huán)境改變可能對骨髓動(dòng)員也存在一定理化方面的影響。

CD34選擇性表達(dá)于人類及哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞表面，且隨著細(xì)胞的成熟逐漸消失，在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、造血干細(xì)胞的運(yùn)輸、炎癥反應(yīng)、淋巴細(xì)胞歸巢等有重要作用。CD117是由c-Kit基因編碼的酪氨酸受體，表達(dá)于造血干細(xì)胞亞群、肥大細(xì)胞等［16-19］。近年來，科學(xué)家將外周血中的干細(xì)胞分成7個(gè)大類，其中CD34+/CD117+的干細(xì)胞屬于早期的內(nèi)皮祖細(xì)胞類（endothelial progenitor cells，EPCs）［20］。現(xiàn)階段有大量的文獻(xiàn)及研究證實(shí)EPC與心腦血管的損傷修復(fù)有著緊密的聯(lián)系，缺血損傷、應(yīng)激、細(xì)胞因子、藥物等因素都可能造成EPC向損傷部位的遷移。EPC可通過自身分化增殖形成新生血管，也可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等細(xì)胞生長因子促進(jìn)本身的血管內(nèi)皮增值改善供血，其具體機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路影響其遷移、Notch/Jagged1信號通路影響其增值分化等有關(guān)［21--24］。

小兒ECC轉(zhuǎn)流對EPC的影響尚無相關(guān)報(bào)道，僅有報(bào)道稱在成人ECC心臟手術(shù)后阿托伐他丁類藥物可能會引起EPC的升高，修復(fù)受損的血管內(nèi)皮［25］，該作者通過隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn)對50例接受過ECC治療的患者研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的各類細(xì)胞因子水平在ECC后均有所升高［白介素（IL）-6，IL-8，粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF），VEGF等］顯示造成了一定的炎癥及內(nèi)皮損傷，而阿托伐他丁類藥物可以促進(jìn)EPC的動(dòng)員，顯著降低了促炎癥因子的水平。由于小兒生長發(fā)育的特殊性及臨床試驗(yàn)的限制，所以本實(shí)驗(yàn)嘗試通過外周血內(nèi)CD34+/c-kit+干細(xì)胞含量間接反應(yīng)EPC的動(dòng)員情況，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)DHCA會造成小兒體內(nèi)此類干細(xì)胞水平的上升，且術(shù)后4-5d更為顯著，而加入SCP的體外轉(zhuǎn)流方式即DHCA+SCP組患者的此類干細(xì)胞的水平與MH組患者的水平一致且都相對較低。從損傷修復(fù)的角度，加入SCP可能減少血管內(nèi)皮的損傷，減輕炎癥，從而降低骨髓動(dòng)員向外周血的CD34+/CD117+干細(xì)胞水平。

DHCA對機(jī)體造成的影響是十分復(fù)雜的，尤其在嬰幼兒生長發(fā)育變化隨年齡有顯著變化的階段，所以，需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究探討其對骨髓動(dòng)員向外周血的CD34+/c-kit+干細(xì)胞的含量變化的原因及機(jī)制，為將來臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ Ferry PC.Neurologic sequelae of open-heart surgery in children.An＇irritating question＇［J］.Am J Dis Child，1990，144（3）：369-373

［2］ Fessatidis IT，Thomas VL，Shore DF，et al.Brain damage after profoundly hypothermic circulatory arrest：correlations betweenneurophysiologic and neuropathologic findings：an experimental study in vertebrates［J］.J Thorac Cardiavasc Surg，1993，106（1）：32-41.

［3］ Hirai S.Systemic inflammatory response syndrome after cardiac surgery under cardiopulmonary bypass［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2003，9（6）：365-370.

［4］ 蘇肇伉，孫勇，楊艷敏，等.深低溫體外循環(huán)方法對嬰兒肺功能的影響［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（1）：41-44.

［5］ Yang Y，Cai J，Su Z，et al.Better protection of pulmonary surfactant integrity with deep hypothermia and circulatory arrest［J］.Ann Thorac Surg，2006，82（1）：131-136.

［6］ 徐志偉，張志芳，朱德明，等.體外循環(huán)深低溫低流量灌注的腦電圖變化［J］.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，1998，2（1）：38-42.

［7］ Schultz S，Creed J，Schears G，et al.Comparison of low-flow cardiopulmonary bypass and circulatory arrest on brain oxygen and metabolism［J］.J Ann Thorac Surg，2004，77（6）：2138-2143.

［8］ Takemoto Y，Li TS，Kubo M，et al.The mobilization and recruitment of c-kit+cells contribute to wound healing after surgery［J］.Plos One，2012，7（11）：e48052.

［9］ Condon ET，Wang JH，Redmond HP.Surgical injury induces the mobilization of endothelial progenitor cells［J］.Surgery，135（6）：657-661.

［10］ Rafii S，Lyden D.Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration［J］.Nat Med，2003，9（6）：702-712.

［11］ Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of EPCs responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization［J］.Circ Res，1999，85（3）：221-228.

［12］ Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.Bone marrow-derived endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse［J］.Circ Res，2002，90（3）：284-288.

［13］ Kalina T，F(xiàn)lores-Montero J，van der Velden VH，et al.Euro-Flow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols［J］.Leukemia，2012，26（9）：1986-2010.

［14］ Ivanovic Z，Kovacevic-Filipovic M，Jeanne M，et al.CD34+ cells obtained from＂good mobilizers＂are more activated and exhibit lower ex vivo expansion efficiency than their counterparts from＂poor mobilizers＂［J］.Transfusion，2010，50（1）：120-127.

［15］ Lemoli RM，Tafuri A，F(xiàn)ortuna A，et al.Biological characterization of CD34+cells mobilized into peripheral blood［J］.Bone Marrow Transplant，1998，22 Suppl 5：S47-50.

［16］ Wells SJ，Bray RA，Stempora LL，et al.CD117/CD34 expression in leukemic blasts［J］.Am J Clin Pathol，1996，106（2）：192-195.

［17］ Ieckband d，Prakasam A.Mechanism and dynamics of cadherin adhesion［J］.Annu Rev Biomed Eng，2006，8：259-287.

［18］ Kirshenbaum AS，Goff JP，Semere T，et al.Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34（+），c-kit（+），and expression aminopeptidase N（CD13）.Blood，1999，94（7）：2333-2342.

［19］ Miettinen M，Lasota J.Kit（CD117）：a review on expression in normal and neoplastic tissues，and mutations and their clinicopathologic correlation［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2005，13（3）：205-220.

［20］ Zhang Y，Huang B.Peripheral blood stem cells：phenotypic diversity and potential clinical applications［J］.Stem Cell Rev，2012，8（3）：917-925.

［21］ Dimmeler S，Aicher A，Vasa M，et al.HMG-CoA reductase inhibitors（statins）increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway［J］.J Clin Invest，2001，108（3）：391-397.

［22］ Taguchi A，Matsuyama T，Moriwaki H，et al.Circulating CD34-positive cells provide an index of cerebrovascular function［J］.Circulation，2004，109（24）：2872-2875.

［23］ Hibbert B，Ma X，Pourdjabbar A，et al.Pre-procedural atorvastatin mobilizes endothelial progenitor cells：clues to the salutary effects of statins on healing of stentend human arteries［J］.PLoS One，2011，6（1）：e16413.

［24］ Hristov M，Weber C.Endothelial progenitor cells：charaterization，pathophysiology and possible clinical relevance［J］.J Cell Mol Med，2004，8（4）：498-508.

［25］ Spadaccio C，Pollari F，Casacalenda A，et al.Atorvastatin increases the number of endothelial progenitor cells after cardiac surgery：a randomized control study［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，55（1）：30-38.

The effects of different temperature and perfusion of cardiopulmonary bypass for the expression of the CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood in infants

Jiang Gan，Xu Zhi-wei
Department of Thoracic cardiac surgery，Shanghai Children＇s Heart center，Shanghai Jiaotong University/School of Medicine，Shanghai 200127，China

Xu Zhi-wei，Email：zwxumd＠gmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of mild hypothermia，deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）and selective cerebral perfusion（SCP）on the expression of CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood in infants.MethodsThirty three infants with congenital cardiac diseases were divided into 3 groups：mild hypothermia group（10 cases），DHCA group（10 cases）and DHCA+SCP group（13 cases）.The expression of CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood were measured before institution of cardiopulmonary bypass（CPB）（T0），12-24 h（T1）and 4-5 d（T2）after cessation of CPB respectively.ResultsThe level of CD34 +/c-kit+stem cells in peripheral blood was significantly high in DHCA group compared with that in the other two groups at T1 and T2（P＜0.01）.ConclusionOur data show that DHCA cause the increase of CD34+/c-kit+stem cells expression in peripheral blood after surgery.

Mild hypothermia；Deep hypothermia circulatory arrest；Selective cerebral perfusion；CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood；Infant

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0079-04

2012-12-27）

2013-03-19）

200127上海，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科

徐志偉，Email：zwxumd＠gmail.com