孔 瓊 ，王云月，楊紅玉 ，張文權 ，鄭 丹

（1．云南農業(yè)大學 農業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2．紅河學院 生物系，云南 蒙自 661100； 3.昆明學院 生命科學與技術系，云南 昆明 650214）

擬南芥具有生長周期短、個體小、種子豐富等優(yōu)良的生物學特性[1]，并能通過組培的方式獲得懸浮細胞[2]，且由于線粒體、葉綠體、核等基因組全長測序工作的相繼完成，使得該植物的應用更加廣泛。植物懸浮細胞因具有材料均一、細胞量大、增殖快、易于控制等特點[3]，現(xiàn)已成為研究寄主植物與病原互作的優(yōu)良材料。而如何快速獲得大量且均一的好的懸浮細胞是進行后期實驗的重要保障。植物細胞懸浮培養(yǎng)受到很多因素的影響，其中蔗糖濃度[4]、初始接種量[5]、轉速[6]等是影響懸浮細胞體系成功的關鍵因素。前人對擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)的研究報道較多，但尚未見到有關懸浮系培養(yǎng)優(yōu)化方面的報道。文中以擬南芥愈傷組織為試驗材料，進行懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗，通過分析不同初始接種量、碳源和轉速對擬南芥懸浮細胞生長的影響問題，篩選到了擬南芥懸浮細胞的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥Arabidopsis thalianaColumbia生態(tài)型種子由美國Lehle seeds提供，愈傷組織由云南農業(yè)大學農業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室誘導獲得。

1.2 培養(yǎng)條件的篩選

1.2.1 不同初始接種量對懸浮細胞生長的影響

分別取1、2、3、4 g白色疏松的愈傷組織接種于 MS（含蔗糖 30 g·L-1）＋1.5 mg·L-12,4-D ＋0.3 mg·L-16-BA＋1 000 mg·L-1水解酪蛋白（Casein acid hydrolysis，CH）液體培養(yǎng)基（150 mL）中，于（25±1）℃、120 r·min-1條件下?lián)u床振蕩避光培養(yǎng)8 d后測定細胞的鮮質量。

1.2.2 蔗糖濃度對懸浮細胞生長的影響

選取1.2.1中的最佳接種量培養(yǎng)10 d后的懸浮細胞，在MS（不含蔗糖）＋1.5 mg·L-12,4-D ＋0.3 mg·L-16-BA＋1 000 mg·L-1CH的培養(yǎng)基里分別附加10、20、30、40 g·L-1等不同質量濃度的蔗糖，于（25±1）℃、120 r·min-1條件下?lián)u床暗培養(yǎng)8 d后測定細胞的鮮質量，以確定最適的蔗糖濃度。

1.2.3 轉速對懸浮細胞生長的影響

以1.2.1和1.2.2的最佳試驗結果為優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，將愈傷組織接入MS＋1.5 mg·L-12,4-D ＋0.3 mg·L-16-BA＋1 000 mg·L-1CH的培養(yǎng)基中，分別于 100、120、140、200 r·min-1和（25±1）℃恒溫條件下?lián)u床暗培養(yǎng)8 d后測量其鮮質量，并觀察細胞生長情況。

1.2.4 懸浮細胞生長曲線與活性變化及pH值變化

將一定量的擬南芥愈傷組織（1.2.1的試驗結果）接種于MS＋最佳蔗糖濃度（1.2.2的試驗結果）＋1.5 mg·L-12,4-D＋0.3 mg·L-16-BA＋1 000 mg·L-1CH的液體培養(yǎng)基中，并置于最佳轉速（1.2.3的試驗結果）下黑暗振蕩培養(yǎng)，溫度為（25±1）℃，培養(yǎng)至第12 天后，每隔2 d分別取樣測其鮮質量和pH值，并對其生長曲線進行繪制，確定其生長周期。

1.3 各種參數(shù)的測定

1.3.1 細胞鮮（干）質量的測定

根據(jù)孔瓊等人[2]的方法每隔2 d測定1次懸浮細胞的生長量，取充分混勻的懸浮細胞8 mL，注入稱重后的10 mL的空離心管內，在高速離心機里以12 000 r·min-1的轉速離心10 min，真空吸去上清液，室溫下敞口自然風干24 h后稱重，減去空離心管質量即為8 mL懸浮細胞液的鮮生物量，并于60 ℃下烘干至恒重后稱取其干質量，重復5次。

1.3.2 細胞活性的測定

文中按照孔瓊等人[2]的方法進行測定，即將0.2 g細胞加入0.6% TTC溶液(用50 mM pH 7.5磷酸緩沖液配制，內含0.05% 的Tween-20) 3 mL，26 ℃下暗培養(yǎng)24 h，10 000×g離心10 min，再將細胞轉入大試管中加入95%乙醇5 mL，80 ℃下水浴20 min，冷卻后10 000×g離心10 min，取上清液于485 nm下進行比色觀測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用Excel簡單統(tǒng)計后用SPSS13.0分析，以最小顯著差數(shù)法(LSD)評價差異的顯著性，數(shù)據(jù)用（平均值±標準差）來表示，并采用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 接種量對懸浮細胞生長的影響

擬南芥懸浮細胞的生長速率與初始接種量的關系見圖1，只有接種量達到一定量時，懸浮細胞才能快速增長；當接種量低于一定濃度時，細胞生長較慢或不生長。本試驗結果表明，擬南芥愈傷組織接種量為4 g時，懸浮細胞生長速度較快，第8 天時細胞鮮質量達到最高，為0.463 4 g；當接種量分別為1 g和2 g時，懸浮細胞增長量的差異不顯著。

圖1 接種量對細胞鮮質量的影響Fig.1 Effect of inoculation quantity on fresh mass of suspension cells

2.2 不同蔗糖量對懸浮細胞生長的影響

在懸浮細胞培養(yǎng)中，蔗糖起著十分重要的作用，它不僅是細胞賴以生長的重要碳源，也是滲透壓調節(jié)劑。不同蔗糖含量對擬南芥懸浮細胞干質量的影響情況如圖2所示。圖2顯示，蔗糖濃度為10～30 g·L-1時，隨著蔗糖濃度的增加，懸浮細胞增殖呈上升趨勢；當蔗糖濃度為30和40 g·L-1時，細胞增殖較快，當蔗糖濃度為30 g·L-1時，細胞增殖最快，蔗糖濃度為40 g·L-1時細胞增殖速度次之，10 g·L-1蔗糖濃度的細胞增殖效果最差。

圖2 蔗糖濃度對細胞干質量的影響Fig.2 Effect of sucrose concentration on dry mass of suspension cells

2.3 轉速對懸浮細胞生長的影響

在最佳接種量和蔗糖濃度的培養(yǎng)條件下，不同振蕩速度對懸浮細胞生長也有一定的影響，擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)的適宜轉速為120～140 r·min-1，過高或過低均不利于細胞生長。轉速對懸浮細胞鮮質量的影響情況如表1。表1結果表明，以轉速為l00 r·min-1培養(yǎng)8 d后，細胞生長緩慢，細胞鮮質量的增加量較小，分散性差，易形成較大的細胞團；當轉速為120 r·min-1時，細胞生長較快，其增長量為（0.622 8±0.014 9）g·mL-1，顯著高于其他處理，且細胞分散性好。但當轉速為140 r·min-1時，細胞增長量反而略有下降，且易被污染，貼壁死細胞較多。

2.4 擬南芥懸浮細胞系的生長曲線、pH值及其活性的變化情況

在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，對擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)過程中細胞鮮質量、pH值或活性的變化情況進行了監(jiān)測，并繪制生長曲線和活性變化圖（見圖3～5）。圖3～5表明，擬南芥懸浮細胞生長呈簡單的“S”型變化規(guī)律，其活性變化與細胞生長量變化關系緊密，而培養(yǎng)過程中營養(yǎng)液pH值呈下降趨勢。從細胞鮮質量的變化中發(fā)現(xiàn)，擬南芥懸浮細胞的延遲期為第2～5 天，對數(shù)生長期為第5～8天，細胞生長速度加快，增殖明顯；從第9天開始進入穩(wěn)定期。根據(jù)細胞活性變化結果，擬南芥懸浮細胞在第2～8天其活性呈上升趨勢，且第8天的活性最高，顯著高于其他處理；隨后細胞活性呈變弱趨勢。在細胞懸浮培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液 pH值呈下降趨勢，其中前8天的pH值下降不明顯；而當細胞生長減緩時，pH值下降逐漸加劇。因此結合細胞生長量和活性變化，可確定出擬南芥懸浮細胞的繼代周期為6～8 d。

表1 轉速對懸浮細胞鮮質量的影響Table 1 Effect of different rotation speeds on fresh mass of suspension cells

圖3 擬南芥懸浮細胞生長pH變化Fig.3 pH value change of suspension cell from Arabidopsisthaliana during culture

3 討 論

3.1 不同接種量對懸浮細胞生長的影晌

大量研究結果表明，接種量對懸浮細胞系的成功建立很關鍵。懸浮細胞生長具有群體效應，若接種細胞密度過低，細胞生長較為緩慢；密度過高，則細胞生長速度過快[7]。因此，只有接種細胞密度適中，細胞才能快速生長，形成良好的分散細胞系。陳琰[8]在研究不同小麥品種懸浮細胞系建立的過程中發(fā)現(xiàn)，初始接種量為0.5～1.5 g（每40 mL培養(yǎng)液），細胞增殖倍數(shù)隨接種量的增加而增加；且1.5 g時達到最大值，且懸浮系顏色鮮艷，分散性好，顆粒均勻；如再增加接種量，細胞增殖卻呈下降趨勢，懸浮培養(yǎng)液也變得渾濁。同樣，草莓[9]和俄羅斯楊[10]懸浮細胞系的建立也需要有一個合適的初始接種量。本試驗中發(fā)現(xiàn)，150 mL培養(yǎng)液中含有4 g擬南芥白色疏松愈傷組織時，懸浮細胞鮮質量增加較快，且繼代培養(yǎng)2～3次后，細胞分散性較好，顆粒均勻，形成含有5～8個的細胞團或單細胞。

圖4 擬南芥懸浮細胞生長曲線Fig.4 Growth curve of suspension cell from Arabidopsisthaliana during culture

圖5 擬南芥細胞系活性變化Fig.5 Viability change of suspension cells from Arabidopsis thaliana

3.2 不同蔗糖量對懸浮細胞生長的影響

在組織培養(yǎng)中，蔗糖既為細胞生長提供碳源，還可作為滲透壓調節(jié)劑。培養(yǎng)基中蔗糖濃度對培養(yǎng)物的生長有明顯的影響，蔗糖濃度過低，不僅不能補充碳源，還會發(fā)生營養(yǎng)物質外滲的現(xiàn)象，最終導致細胞死亡；若過高也會因細胞內水分外滲而出現(xiàn)生理性缺水現(xiàn)象[11]。因此，在懸浮細胞培養(yǎng)體系中確定最佳蔗糖濃度是必不可少的，通常在培養(yǎng)基中需要加入20～30 g·L-1的蔗糖作為培養(yǎng)基碳源。在本實驗中，當蔗糖濃度為10～30 g·L-1時，隨著蔗糖濃度的增加擬南芥懸浮細胞增殖呈上升趨勢；而蔗糖濃度為30～40 g·L-1時，細胞增殖較慢且呈下降趨勢，因此，在擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)中，蔗糖的最佳濃度為30 g·L-1。

3.3 轉速對細胞長勢、結團和貼壁現(xiàn)象的影響

前人在研究煙草[12]懸浮細胞系建立時發(fā)現(xiàn)，不同轉速對細胞長勢、分散性及貼壁現(xiàn)象具有較大影響，其中于110～140 r·min-1轉速下，能夠獲得長勢好的分散性細胞系。由于轉速可為懸浮細胞生長提供氧氣和機械力，轉速較低時，懸浮培養(yǎng)基中的氧含量不足，從而限制了懸浮細胞的生長，產生較小的機械力，子細胞和母細胞不易分離，所以易發(fā)生結團現(xiàn)象，若轉速太高，則容易產生對細胞傷害的剪切力，因此，選擇合適的轉速也是建立良好懸浮細胞系的基本條件。本實驗中觀察不同轉速下懸浮細胞的形態(tài)特征后發(fā)現(xiàn)，擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)的適宜轉速為120～140 r·min-1，其中最適轉速為 120 r·min-1。

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