田壽樂，孫曉莉，沈廣寧，許 林

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

花粉是植物種質(zhì)的形式之一，具有豐富的遺傳多樣性，因其含有該物種的所有基因類型，已被廣泛用于種質(zhì)保存、交換以及新種質(zhì)創(chuàng)新等研究領(lǐng)域，如在解決雜交育種中花期不遇問題和開展異地授粉、定向育種工作時(shí)具有很強(qiáng)的可操作性。但在自然條件下，許多花粉的壽命非常短，各種環(huán)境因素如溫度、濕度、水分、大氣成分、大氣壓力等均可影響花粉活力。Beny等人[1]發(fā)現(xiàn)，高濃度的 CO2（800 μmol·mol-1）能緩和由于高溫而造成的花粉活力下降，但O2則有相反的作用。另外，由于種質(zhì)間的遺傳差異性，花粉萌發(fā)特性千差萬別，因此給種質(zhì)保存及創(chuàng)新帶來困難。板栗Castanea mollissimaBl.、日本栗C. crenataSieb. & Zucc.、 茅 栗C.seguiniiDode和錐栗C.henryiRehd. & Wils.同屬山毛櫸科 Fagaceae 栗屬Castanea，是我國栗屬植物的主要種，在我國均有大范圍的分布，在部分地區(qū)常處于混生狀態(tài)。據(jù)報(bào)道，栗屬不同種的植物可相互雜交，并產(chǎn)生了自然雜交種，如‘曹茍栗’[2]、‘利平栗’[3]等。為深入利用我國現(xiàn)有栗屬植物的優(yōu)勢(shì)資源，實(shí)現(xiàn)新種質(zhì)創(chuàng)新，開展對(duì)栗屬花粉的研究尤為必要和迫切，但目前有關(guān)栗屬花粉特性等基礎(chǔ)性研究的報(bào)導(dǎo)甚少，相關(guān)研究多集中于新品種選育、栽培技術(shù)及采用處理等應(yīng)用領(lǐng)域。文中以中國栗屬4個(gè)種的花粉為材料，研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)花粉萌發(fā)率的影響，以期為栗屬花粉的長期保存和種間雜交授粉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為板栗、日本栗、茅栗和錐栗在盛花期的花粉，均采自山東省果樹研究所板栗資源圃里的實(shí)生樹，樹齡5～8年，生長正常。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2011年5月至2012年5月進(jìn)行。雄花序當(dāng)天采集后陰干晾曬12 h，然后放入干燥器內(nèi)于0、－20、－70 ℃下保存?zhèn)溆谩?duì)培養(yǎng)基糖類組分及質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、干燥時(shí)間、播散密度及貯藏溫度進(jìn)行單因素篩選。設(shè)置9種固體培養(yǎng)基，各組分及配比如表1所示，高溫滅菌充分冷卻后接種花粉。培養(yǎng)溫度設(shè)置為5個(gè)水平：24、27、30、33、36 ℃；花粉干燥采用室內(nèi)自然晾曬法，設(shè)置5個(gè)水平：0、12、24、36、48 h；花粉播散密度設(shè)置4個(gè)水平：（100±10）粒/視野、（250±25）粒/視野、（400±40）粒/視野、（550±55）粒/視野；培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置6個(gè)水平：6、12、18、24、30、36 h；貯藏溫度設(shè)置3個(gè)水平：0、－20、－70 ℃。培養(yǎng)過程中各處理光照強(qiáng)度均設(shè)定為12×103Lux。各單因素試驗(yàn)均在其它因素最優(yōu)情況下進(jìn)行?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管長度超過花粉赤道軸長度的1倍為準(zhǔn)。用Olympus-CH顯微鏡40×物鏡下測(cè)量萌發(fā)前花粉極軸和赤道軸長度，50個(gè)重復(fù)。每處理設(shè)置3個(gè)玻片，每個(gè)玻片隨機(jī)觀測(cè)5個(gè)視野。

表1 培養(yǎng)基處理及組分Table 1 Treatments and compositions of media

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD法）；制圖采用 Excel 軟件。顯著性水平設(shè)定α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉形態(tài)

栗屬4種花粉形態(tài)特征如表2所示。由表2可知，4種栗屬植物花粉形狀基本一致，均為長橢圓形，極軸15.1～21.5 μm，赤道軸5.6～9.7 μm；外壁輪廓較平滑，具3條萌發(fā)溝，溝細(xì)長，并延伸至兩極，花粉管著生在萌發(fā)溝中部，僅從形態(tài)上4種花粉難以區(qū)分。經(jīng)P×E測(cè)算，花粉粒大小依次為板栗、茅栗、錐栗、日本栗，其中板栗花粉極軸和赤道軸長度分別達(dá)到19.6 μm和8.4 μm，均顯著高于其它3種栗屬花粉，這與馬常耕等人[4]的描述基本一致。茅栗P/E值為2.2，略小于其它3種栗屬花粉，形態(tài)上表現(xiàn)為稍細(xì)長。

表2 4種栗屬植物花粉的形態(tài)特征?Table 2 Pollen morphology of the four species in Castanea

2.2 培養(yǎng)基糖類組分及濃度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響

糖類不僅為細(xì)胞生長提供C元素，而且在用固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行花粉培養(yǎng)時(shí)還起到維持細(xì)胞水勢(shì)的作用，避免了花粉因過度吸水而導(dǎo)致膨脹，并影響到萌發(fā)。本實(shí)驗(yàn)不同培養(yǎng)基組分及配比對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響如表3所示。從表3分析可知，在無添加任何糖類組分的情況下，對(duì)照組栗屬花粉均處于極低的萌發(fā)率，且花粉粒膨脹嚴(yán)重，P/E可達(dá)1.1，近似圓球形。培養(yǎng)基糖類濃度對(duì)花粉萌發(fā)率影響非常明顯，4種栗屬花粉均以5%濃度水平萌發(fā)率最高，其次為10%和15%濃度水平，表現(xiàn)為萌發(fā)率隨糖類濃度的升高而降低，同時(shí)表明栗屬花粉萌發(fā)對(duì)最佳糖類濃度的選擇性趨于一致。試驗(yàn)表明，不同糖類組分對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響較為復(fù)雜，以5%濃度水平為例，板栗和日本栗花粉在砂糖培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高，葡萄糖培養(yǎng)基上最低；錐栗在砂糖培養(yǎng)基上萌發(fā)率也最高，但在蔗糖培養(yǎng)基上最低，二者相差達(dá)13.2%；茅栗在蔗糖培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，在葡萄糖培養(yǎng)基上最低，二者相差6.0%。在蔗糖組分下，板栗花粉在5%濃度水平的萌發(fā)率最高，達(dá)到81.5%，顯著高于10%和15%濃度水平 ，這與結(jié)果夏仁學(xué)[5]在板栗上的研究相似，但與謝治芳[6]的研究結(jié)果存在一定差異。由此可見，在糖類5%濃度水平，4種花粉均保持了較高萌發(fā)率，其中砂糖可作為板栗、日本栗和錐栗花粉培養(yǎng)的首選糖類組分，蔗糖則可作為茅栗的首選糖類組分。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)4種栗屬植物花粉萌發(fā)率的影響Table 3 Effect of different media on pollen germination rates of the four species in Castanea %

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響

植物花粉萌發(fā)所需溫度是由自身生理特征決定的，只在適宜的溫度區(qū)間具有較高萌發(fā)率，且這個(gè)溫度區(qū)間因物種不同相去甚遠(yuǎn)。一般在早春開花的植物其花粉萌發(fā)所需溫度較低，如榛子花粉萌發(fā)僅需10 ℃[7]，風(fēng)信子品種‘安娜瑪麗’花粉離體培養(yǎng)最適溫度為15 ℃[8]，大櫻桃花粉萌發(fā)的適宜溫度為18～25 ℃[9]。板栗等4種栗屬植物盛花期一般在5月底至6月上中旬，期間氣候炎熱干燥，顯然栗屬花粉萌發(fā)已適應(yīng)這種氣候特點(diǎn)。室內(nèi)不同培養(yǎng)溫度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響如圖1所示。4種花粉在24 ℃時(shí)基本不萌發(fā)，在27 ℃萌發(fā)率保持在較低水平，約10%～17%。當(dāng)溫度由27 ℃上升至30 ℃時(shí)，各種花粉萌發(fā)率均大幅提高，其中日本栗萌發(fā)率達(dá)到最大值73.1%，此后隨溫度升高呈緩慢下降趨勢(shì)。結(jié)合日本栗盛花期較早的特點(diǎn)，可初步判斷日本栗花粉萌發(fā)特點(diǎn)可能與其盛花期溫度稍低有關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)溫度上升至33 ℃時(shí)，板栗、茅栗和錐栗萌發(fā)率均達(dá)到最高，分別為78.0%、77.3%和76.8%，這一結(jié)果與夏仁學(xué)[5]在板栗上的研究略有差異，符合鄭誠樂[10]對(duì)錐栗的試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)上述分析可知，30～36 ℃較適宜栗屬花粉萌發(fā)，且4種栗屬花粉萌發(fā)率均保持在50%以上。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響

植物花粉萌發(fā)所需時(shí)間存在很大差異，少則十幾分鐘，多則幾十小時(shí)。棗花粉萌發(fā)速度較快，在適宜溫度下培養(yǎng)0.5 h萌發(fā)率即在60%以上[11]。梨在適宜條件下培養(yǎng)3 h萌發(fā)率達(dá)到67%以上[12]；桃花粉萌發(fā)率在培養(yǎng)前3 h內(nèi)上升最快，3～5 h上升趨勢(shì)減弱，5 h后基本停止[13]。培養(yǎng)時(shí)間長短對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響如圖2所示，栗屬花粉萌發(fā)需要較長時(shí)間，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，各種花粉萌發(fā)趨勢(shì)基本相同，萌發(fā)率均呈“S”型曲線增長。從圖2可以看出，在0～6 h內(nèi)各種花粉萌發(fā)率均處于較低水平，至6 h時(shí)萌發(fā)率最高也不超過10%；在6～24 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，各種花粉萌發(fā)率大幅上升，其中板栗增長幅度最大，每小時(shí)增長率達(dá)到3.6%；在24～36 h內(nèi)4種花粉萌發(fā)速率放緩，花粉萌發(fā)數(shù)量較前期明顯減少。培養(yǎng)至36 h，各種花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，板栗萌發(fā)率最高，為79.6%，其次為日本栗、錐栗和茅栗。

圖1 培養(yǎng)溫度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of culture temperature on pollen germination rate in Castanea

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of culture time on pollen germination rate in Castanea

2.5 干燥時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

花粉干燥是花粉貯藏過程中必不可少的環(huán)節(jié)，其一有助于花粉從花粉囊中散落，其二可降低花粉中的水分，利于干燥保存。干燥時(shí)間長短其實(shí)質(zhì)是影響花粉自身含水量，適度干燥可提高萌發(fā)率，而過度干燥則導(dǎo)致萌發(fā)率下降。干燥時(shí)間長短對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響如圖3。采后未經(jīng)干燥的4種栗屬花粉萌發(fā)率均在70%左右，經(jīng)過12 h晾曬后，4種花粉萌發(fā)率均有所上升并達(dá)到最高，其中板栗花粉萌發(fā)率上升幅度最大，較未干燥處理提高了8.4%，日本栗上升幅度最小，提高了3.3%。干燥時(shí)間超過12 h后，各種花粉萌發(fā)率呈明顯下降趨勢(shì)，干燥至24 h時(shí)，4種花粉萌發(fā)率下降至干燥前水平。超過24 h后，各種花粉萌發(fā)率隨干燥時(shí)間延長呈加速下降趨勢(shì)，至48 h降至最低，其中日本栗下降速度最快，萌發(fā)率降至29.4%，茅栗花粉萌發(fā)率稍高于其它3種，但也僅為39.2%。

圖3 干燥時(shí)間對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of drying time on pollen germination rate in Castanea

2.6 花粉密度對(duì)萌發(fā)率的影響

花粉萌發(fā)具有集體效應(yīng)，即在一定面積內(nèi)，花粉數(shù)量越多萌發(fā)越好[14]，這一點(diǎn)在栗屬植物上均得到充分體現(xiàn)。不同花粉密度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響如圖4所示。4種栗屬花粉在低密度水平均保持較低萌發(fā)率，密度為100粒/視野和250粒/視野時(shí)，4種栗屬花粉萌發(fā)率極低，平均僅達(dá)到在10%左右，其中日本栗花粉萌發(fā)率明顯低于其它3種；花粉播撒密度增大至400粒/視野時(shí)，各種花粉萌發(fā)率均顯著上升，茅栗萌發(fā)率最高，為36.0%。當(dāng)花粉密度達(dá)到550粒/視野時(shí)，4種花粉萌發(fā)數(shù)量驟增，萌發(fā)率均躍居65%以上，其中日本栗最高，達(dá)到79.5%，萌發(fā)率較100粒/視野水平時(shí)提高了近98倍。據(jù)此可知，花粉密度與花粉萌發(fā)率呈明顯正相關(guān)，為保證高質(zhì)量的授粉受精效果，應(yīng)盡量提高授粉密度，并且這在人工雜交育種時(shí)尤為重要。

2.7 貯藏溫度對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

低溫、超低溫貯藏是目前花粉保存最常用的方法，已經(jīng)涵蓋了農(nóng)作物、果樹、蔬菜、藥材、牧草、經(jīng)濟(jì)作物以及園林植物等[15-23]，對(duì)種質(zhì)資源保存和雜交育種意義重大。不同貯藏溫度對(duì)花粉萌發(fā)率的影響如表4所示。由表4分析看出，在相同低溫處理下4種花粉隨貯藏時(shí)間延長其萌發(fā)率均有不同程度下降?？傮w來說，－20 ℃貯藏效果要明顯好于0 ℃和－70 ℃。在－20 ℃低溫下貯藏30 d時(shí)，各種花粉萌發(fā)率依然保持在高水平，平均萌發(fā)率高達(dá)73.8%；至貯藏360 d時(shí)，4種花粉平均萌發(fā)率仍達(dá)到23.4%，遠(yuǎn)高于0 ℃和－70 ℃處理；在此溫度下，板栗花粉萌發(fā)率月平均下降幅度最大，為5.2%，日本栗最小，為3.7%。－70 ℃處理效果稍好于0 ℃處理，在貯藏至360 d時(shí)4種花粉仍有少量萌發(fā)。0 ℃處理下各種花粉萌發(fā)率均較低，最主要原因可能是該溫度未能有效抑制花粉呼吸作用，導(dǎo)致能量大量消耗所致，因此0 ℃最不適合4種花粉的長期貯藏。

圖4 花粉密度對(duì)栗屬花粉萌發(fā)率的影響Fig.4 Effect of pollen density on pollen germination rate in Castanea

表4 貯藏溫度對(duì)花粉萌發(fā)率的影響Table 4 Effect of storage temperature on pollen germination rate %

3 討 論

3.1 栗屬花粉形態(tài)

中國栗屬4種花粉形態(tài)基本一致，具有相似的萌發(fā)孔溝，且花粉管萌發(fā)位置均位于萌發(fā)溝中部，其形態(tài)與石櫟屬Lithocarpus和錐屬Castanopsis[24]花粉非常相似，在光學(xué)顯微鏡下難以區(qū)分。經(jīng)P×E測(cè)算，花粉粒大小依次為板栗、茅栗、錐栗、日本栗。

3.2 影響栗屬花粉萌發(fā)的因素

對(duì)于大多數(shù)植物而言，花粉萌發(fā)受溫度、濕度、花粉密度、糖類種類等環(huán)境因素和自身生理因素的影響[25]。糖類物質(zhì)是花粉萌發(fā)及花粉管生長的重要能量物質(zhì)，在花粉試驗(yàn)中多采用蔗糖作為糖類添加物，也有用葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖甚至多種糖類混用的報(bào)道[26-27]。本試驗(yàn)探討了單糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）及砂糖（含單糖、二糖、多糖）對(duì)栗屬花粉萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，栗屬4種花粉對(duì)不同糖類組分及其濃度的選擇具有專一性，在不含糖培養(yǎng)基上各種花粉幾乎不萌發(fā)，而在5%糖類濃度下各種花粉萌發(fā)率均顯著高于10%和15%的濃度處理，這與趙長星等人[28]研究認(rèn)為大多數(shù)樹種花粉在10%蔗糖濃度下發(fā)芽最好的結(jié)論具有一定差異。在5%濃度處理下，板栗、日本栗和錐栗花粉在砂糖培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高，而茅栗在蔗糖培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高，體現(xiàn)了不同屬、種間花粉萌發(fā)對(duì)能量物質(zhì)需求的特異性。高溫炎熱干燥氣候有利于栗屬植物花粉的散粉和萌發(fā)，這是自然選擇的結(jié)果。本研究基于對(duì)盛花期前后溫度的模擬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在30～36 ℃高溫下，栗屬4種花粉均保持較高萌發(fā)率，其中中國原產(chǎn)種板栗、茅栗和錐栗花粉在33 ℃時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最高，而引入種日本栗在30 ℃時(shí)達(dá)到最高，這與日本栗花期早于其它3種密切相關(guān)。栗屬4種花粉萌發(fā)需要較長時(shí)間，培養(yǎng)36 h后萌發(fā)率均達(dá)最大值，其中在24 h以內(nèi)萌發(fā)率迅速增加，超過24 h后萌發(fā)率變化不大，萌發(fā)數(shù)量明顯減少，可以確定授粉后24 h內(nèi)是各種栗屬花粉萌發(fā)能力最強(qiáng)的階段。花粉干燥可減少花粉含水量，降低新陳代謝，起到強(qiáng)制休眠的作用。研究表明，4種花粉干燥12 h萌發(fā)率達(dá)到最大，干燥24 h其花粉萌發(fā)率仍然保持在67%以上，超過24 h后萌發(fā)率快速下降，其主要原因是由于花粉過度失水所致。花粉的集體效應(yīng)對(duì)于促進(jìn)花粉萌發(fā)具有顯著作用，栗屬花粉屬于典型的風(fēng)媒花，體積小、質(zhì)量輕而且數(shù)量多，花粉萌發(fā)具有依賴集體效應(yīng)的天然優(yōu)勢(shì)。許清海等人[29]研究表明，大氣中花粉濃度與板栗產(chǎn)量變化呈正相關(guān)。本試驗(yàn)證實(shí)栗屬4種花粉萌發(fā)率均隨花粉密度的增大而快速提高，當(dāng)花粉密度達(dá)到550粒/視野時(shí)，各種花粉萌發(fā)率均在65%以上，因此在人工雜交育種時(shí)，要充分利用花粉集體效應(yīng)的特點(diǎn)，通過增加花粉點(diǎn)授數(shù)量來提高雜交結(jié)實(shí)率。低溫貯藏是種質(zhì)離體保存的重點(diǎn)發(fā)展方向，也是花粉保存的主要方法。由于花粉活力受其基因型控制，不同物種花粉對(duì)各種貯藏條件的反應(yīng)有著很大差異[30]，但總體認(rèn)為低溫有力于花粉的長期貯藏。本試驗(yàn)結(jié)果表明，－20 ℃低溫是栗屬花粉較為理想的貯藏溫度，在此溫度下各種花粉經(jīng)數(shù)月保存后仍能保持較高萌發(fā)率，但要做到連年保存其效果不容樂觀。0 ℃低溫貯藏效果最差，主要原因是在該溫度下花粉仍能進(jìn)行呼吸代謝等生理活動(dòng)，加劇了細(xì)胞衰老進(jìn)程，導(dǎo)致花粉活力快速下降。－70 ℃低溫效果好于0 ℃，但明顯不及－20 ℃低溫，貯藏30 d后萌發(fā)率均不到50%，并隨貯藏時(shí)間延長快速下降。綜合分析，－70℃貯藏效果不佳的原因應(yīng)是多方面的，其一，受花粉含水量的影響。從已有相關(guān)研究結(jié)果來看，花粉含水量是影響花粉超低溫保存的重要因子，含水量越高，冷凍時(shí)越容易形成冰晶，使細(xì)胞膜受損，加速花粉死亡。Rajasekharan等人[31]認(rèn)為花藥的自然干燥有助于保持最佳的花粉生活力。其二，受超低溫保存過程的影響?；ǚ鄢蜏乇４娉绦驈?fù)雜且專一性強(qiáng)，由花粉采集、干燥、密封包裝、存放、解凍、應(yīng)用等基本流程構(gòu)成[20]，任何環(huán)節(jié)都會(huì)影響其活力。另外，不同種、屬間花粉的生理差異，也是影響超低溫保存效果的重要因素。因此，有針對(duì)性的研究花粉在低溫、超低溫保存前后的生理生化特征，以及解決超低溫貯藏過程中的技術(shù)障礙，仍是今后栗屬花粉種質(zhì)長期保存的重要課題。

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