王弦云,朱曉敏,王 勤,束慶龍,康向陽,吳山忠,周明善,張良富,曹翠萍
( 1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院,安徽 合肥 230036;2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083;3.安徽省歙縣特種經(jīng)濟林場,安徽 歙縣 245900)
簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性 (ISSRs: intersimple sequence repeats) 是 Zietkeiwitcz等人[1]于1994年發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星 (microsatellites或稱簡單序列重復(fù)SSRs:simple sequence repeats) DNA基礎(chǔ)上的分子標記。其基本原理是,用錨定的微衛(wèi)星 DNA 為引物,即在 SSR 序列的 3′ 端或 5′ 端加上2~4個隨機核苷酸,導(dǎo)致位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的 DNA 片段進行 PCR(polymerase chain reaction) 擴增。與其他分子標記技術(shù)相比,ISSR 分子標記技術(shù)具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、成本低、操作簡便、不需要預(yù)先知道靶序列信息等優(yōu)點,在群體遺傳多樣性分析[2-4]、品種鑒定[5-6]、遺傳圖譜構(gòu)建[7]等研究中已得到廣泛應(yīng)用。
杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是杜仲科Eucommiaceae杜仲屬EucommiaOliv. 雌雄異株落葉喬木,是我國特有的第三紀孑遺植物。杜仲在我國的分布區(qū)域很廣,水平分布為北緯25°~35°,東經(jīng)104°~119°,基本上位于長江中下游地區(qū),即北自甘肅、陜西、山西,南至福建、廣東、廣西,東迄浙江,西抵四川、云南,中經(jīng)安徽、湖北、湖南、江西、河南、貴州的十五個省區(qū)[8-9]。杜仲是我國名貴的藥用植物,在我國首部藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》中就記載了杜仲樹皮具有補肝腎、強筋骨、安胎、降壓的功效。此外,杜仲全樹的各種組織和器官都含有硬橡膠(又名杜仲膠),是制造電器特別是海底電纜必要的絕緣材料;其木材也是制作家具、農(nóng)具和舟船的良好的原材料;同時,杜仲根系發(fā)達,抗性強,對土壤要求不嚴格,是綠化國土的首選樹種之一。因此,種植杜仲具有良好的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。
目前國內(nèi)外對于杜仲的研究主要集中在杜仲的育苗、栽培和杜仲生物學(xué)、生理生化、化學(xué)成分分析及藥理藥效等方面。我國的科研工作者近年來開展了杜仲遺傳學(xué)方面的研究,如杜仲染色體的誘導(dǎo)加倍[10-12],一些分子標記技術(shù)在杜仲研究中也得到了應(yīng)用,如 RAPD[13]和 AFLP[14]用于杜仲的性別鑒定,RAPD[15]、FLP[16]和 cpSSR[16]用于杜仲遺傳多樣性的研究,而有關(guān)ISSR應(yīng)用于杜仲遺傳多樣性研究的報道尚鮮見。本研究旨在建立適合杜仲的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系,并篩選出具有多態(tài)性的有效引物,為進一步開展杜仲多居群的遺傳多樣性研究提供技術(shù)支撐。
實驗材料采集于安徽省巢湖市廬江縣湯池鎮(zhèn)百花林場,選擇30棵健康的杜仲植株,各樣本的單株間距至少10 m,采集當年生的幼嫩葉片,分別編號并裝入塑料袋中,帶回實驗室,置于-70 ℃的冰箱中保存。
1.2.1 DNA提取
采用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN,德國)試劑盒和細胞破碎儀(TissueLyser II,德國)提取葉片基因組 DNA。將DNA在 0.8%的瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液下電泳,經(jīng)EB染色后在紫外燈下拍照,杜仲基因組DNA如圖1所示。利用微量分光光度計NanoDrop ND-1000檢測到DNA的濃度為 70 ng·μL-1,純度OD 值 (A260/A280) 約為1.8,然后將 DNA 放在-20 ℃ 的冰箱中保存以備用。
圖1 杜仲基因組DNAFig.1 Genomic DNA in E. ulmoides
1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立
為了確定 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中模板DNA、dNTP、引物、Mg2+、Taq DNA聚合酶5個因素的最適反應(yīng)濃度,采用5因素4水平的正交試驗,結(jié)果如表1所示;然后通過對正交試驗設(shè)計(如表2所示)中的16個反應(yīng)體系分別進行測試和比較,找出擴增效果最好的因素組合,確定為最佳的反應(yīng)體系。
實驗用Trans2KTMPlus DNA Marker(北京全式金)作為分子量標準,其他試劑則購自生工生物工程上海有限公司 (Sangon)。選用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物 (UBC Primer set # 9,University of British Columbia,Vancouver,Canada),由 Sangon公司合成。 正交試驗所用引物為 UBC835,ISSR-PCR 反應(yīng)總體積為 20.0 μL,包括表1和表2中的5個因素,此外每個反應(yīng)體系中還需加入2.8 μL 10×PCR的緩沖液,總體積不足20.0 μL時,用HPLC超純水補齊。在 BIORAD PCR 儀 (S1000TM Thermal Cycler) 中進行PCR 反應(yīng),擴增程序為:94 ℃,預(yù)變性5 min;36個循環(huán):94 ℃,變性45 s,59.2 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s;最后,72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物在 1.5% 瓊脂糖凝膠、100 V電壓和 1×TAE的緩沖液條件下電泳30 min,經(jīng) EB 染色,紫外燈下拍照,檢測擴增效果。將16個反應(yīng)體系的結(jié)果相互比較,最后確定最佳的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系。
表1 杜仲ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗的設(shè)計因素與水平?Table 1 Factors and levels of ISSR-PCR system of E. ulmoides in orthogonal design
表2 杜仲ISSR-PCR 反應(yīng)的 L16 (45)正交試驗設(shè)計Table 2 The orthogonal experimental design L16 (45) of ISSR-PCR of E. ulmoides
1.2.3 ISSR-PCR引物篩選
根據(jù)已建立的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系,對60條ISSR隨機引物進行測試,從中篩選出條帶清晰、位點多、多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物,以用于分析杜仲的ISSR遺傳多樣性。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
對篩選出的引物的電泳圖譜進行判讀,每個位點上有條帶的記為1,無條帶的則記為0,獲得由0和1組成的二元式矩陣,然后用POPGENE version 1.31軟件計算多態(tài)性位點數(shù)N、多態(tài)性位點百分率PPL、等位基因觀測數(shù)na、期望雜合度He[17]、有效等位基因數(shù)ne[18]及Shannon多態(tài)性信息指數(shù)I[19]等遺傳多樣性參數(shù)。
對表2中的16個反應(yīng)體系分別進行測試和比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),反應(yīng)體系11的擴增效果最好,其條帶清晰,非特異性條帶較少,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,拍照如圖2。因此,將其確定為杜仲的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系,其總體積為20.0 μL,具體包括 DNA (5 ~ 10 ng·μL-1) 2.0 μL、dNTP (10 mmol·L-1) 0.25 μL、引物 (10 μmol·L-1) 0.7μL、Mg2+(25 mmol·L-1) 2. 4 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.2 μL、10×PCR 緩沖液 2.8 μL、HPLC水 11.65 μL。
根據(jù)已建立的杜仲ISSR-PCR反應(yīng)體系,從60條隨機引物中篩選出了條帶清晰、擴增位點多、多態(tài)性高且重復(fù)性好的引物14條。另外,引物的退火溫度也影響了杜仲ISSR-PCR的擴增效果,引物不同,退火溫度也可能不同。實驗篩選出的引物名稱及其序列和退火溫度如表3所示。
用已篩選出的上述14條引物,對所有實驗樣本進行ISSR-PCR擴增和遺傳多樣性分析,結(jié)果見表4。由表4可知,共擴增出108條譜帶,擴增產(chǎn)物的大小介于250~3 000 bp之間,其中多態(tài)性位點數(shù)N為108,多態(tài)性位點百分率(PPL)為100%,觀測等位基因數(shù)na為2.000,有效等位基因數(shù)ne為1.505,期望雜合度He為0.308,多態(tài)性信息指數(shù)I為0.472。
圖2 杜仲ISSR-PCR正交試驗設(shè)計反應(yīng)體系11的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 (引物UBC835)Fig.2 Result of Agarose gel electrophoresis of reaction system 11 in ISSR-PCR orthogonal experimental design of E. ulmoides by using primer UBC835
表3 引物序列及其退火溫度?Table 3 The primer sequences and annealing temperatures
表4 杜仲遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters in E. ulmoides
影響PCR反應(yīng)的因素有多種,其中DNA是PCR反應(yīng)的模板,dNTP是 ISSR-PCR反應(yīng)的原材料,引物與DNA靶序列結(jié)合引導(dǎo)PCR反應(yīng),Mg2+是Taq酶的激活劑,因此,實驗中ISSR-PCR 反應(yīng)體系受模板DNA、dNTP、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶等因素及因素間相互作用的影響,不同反應(yīng)體系中各因素水平的組合不同,也就產(chǎn)生了不同的ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果。為此,本實驗采用正交試驗找出了各因素水平間的最優(yōu)組合,并確定其為最佳反應(yīng)體系。
研究結(jié)果表明,杜仲的多態(tài)性位點百分率(PPL)為 100%,有效等位基因數(shù)ne為 1.505,期望雜合度He為 0.308,多態(tài)性信息指數(shù)I為0.472,基于同樣的分子標記技術(shù),與其他樹種相比,其遺傳多樣性程度略高于雌雄異株的銀杏[20](ne=1.43,He= 0.26,I= 0.39),高于雌雄同株的白花泡桐[21](ne= 1.39,He= 0.24,I= 0.38),這可能跟杜仲的生物學(xué)特性有一定的關(guān)系。因為杜仲是雌雄異株植物,其后代以種子繁殖為主,雌雄株間基因交流方式屬于異交,因而增加了種群的遺傳多樣性,所以,杜仲的遺傳多樣性程度高于白花泡桐。由于本實驗結(jié)果是僅基于一個群體的初步研究結(jié)果,杜仲群體的遺傳多樣性程度還有待于通過對多居群的研究進行評價。本研究從分子水平上揭示出杜仲具有較高的遺傳多樣性,表明 ISSR 分子標記技術(shù)適用于杜仲遺傳多樣性的研究,這為進一步研究杜仲多居群的遺傳多樣性奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
參考文獻:
[1]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics,1994,20: 176-183.
[2]Cai Y,Sun DK,Wu GJ,et al. ISSR-based genetic diversity of Jatropha curcas germplasm in China [J]. Biomass and Bioenergy,2010,34: 1739-1750.
[3]Arif M,Zaidi NW,Singh YP,et al. A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in shisham (Dalbergia sissoo) [J]. Plant Molecular Biology Reporter,2009,27: 488-495.
[4]Parsaeian M,Mirlohi A,Saeidi G. Study of genetic variation in sesame (Sesamum indicumL) using agro-morphological traits and ISSR markers[J]. Genetika,2011,47: 359-367.
[5]Xie Y,Li JY,Fan ZQ,et al. DNA extraction and ISSR primer screening ofCamellia chekiangoleosa[J]. Agricultural Science& Technology,2011,12: 825-828.
[6]Ye YM,Zhang JW,Ning GG,et al. A comparative analysis of the genetic diversity between inbred lines ofZinniaelegant using morphological traits and RAPD and ISSR markers [J]. Sciatica Horticulture,2008,118: 1-7.
[7]Lu JJ,Zhao HY,Suo NN,et al. Genetic linkage maps ofDendrobium moniliformeandD. officinalebased on EST-SSR,SRAP,ISSR and RAPD markers[J]. Scientia Horticulturae,2012,137: 1-10.
[8]張康健.杜仲[M].北京:中國林業(yè)出舨社,1990.
[9]張康健.中國杜仲研究[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版杜,1992.
[10]高 鵬,林 威,康向陽.秋水仙堿誘導(dǎo)杜仲花粉染色體加倍的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,26(4): 39-43.
[11]張煥玲,李俊紅,李周岐.秋水仙素處理杜仲種子誘導(dǎo)多倍體的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2008,23 (1): 78-81.
[12]張海鳳,郭寶林,張成合,等.杜仲四倍體的誘導(dǎo)與鑒定[J].園藝學(xué)報,2008,35(7):1047-1052.
[13]Xu WJ,Wang BW,Cui KM. RAPD and SCAR markers linked to sex determination inEucommia ulmoidesOliv [J]. Euphytica,2004,136: 233-238.
[14]Wang DW,Li Y,Li ZQ. Identification of a male-specific amplified fragment length polymorphism (AFLP) and a sequence characterized amplified region (SCAR) marker inEucommia ulmoidesOliv [J]. International Journal of Molecular Sciences,2011,12: 857-864.
[15]王璦琦,黃璐琦,邵愛娟,等.孑遺植物杜仲的遺傳多樣性RAPD分析和保護策略研究[J]. 中國中藥雜志,2006,31(19):1583—1586.
[16]Yao XH,Deng JY,Huang HW. Genetic diversity inEucommia ulmoides(Eucommiaceae),an endangered traditional Chinese medicinal plant[J]. Conservation Genetics,2012,(6): 1499-1507.
[17]Crow JF,Kimura M. An introduction to population genetics theory [M]. Minneapolis: Burgess Publishing Company,1970.
[18]Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1973,70: 3321-3323.
[19]Lewontin RC. The apportionment of human diversity [J].Evolutionary Biology,1972,(6): 381-398.
[20]王 利,陳 述,董金偉,等.古銀杏種質(zhì)親緣關(guān)系及遺傳多樣性的ISSR分析 [J].經(jīng)濟林研究,2010,28 (3): 20-24.
[21]李芳東,袁德義,莫文娟,等.白花泡桐種源遺傳多樣性的ISSR分析 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2011,31 (7): 1-7.