李陽(yáng)，薛文通

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

隨著快速的城市化發(fā)展、消費(fèi)者需求的日益變化以及國(guó)際食品貿(mào)易的增加，世界各地食品安全事件的發(fā)生呈現(xiàn)井噴狀。目前影響食品安全的生物因素中，食物過(guò)敏問(wèn)題已經(jīng)尤為突出。據(jù)我國(guó)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，約有6%的6歲以下兒童以及2%的成年人都會(huì)對(duì)食物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，而在美國(guó)每年約有三萬(wàn)起食物過(guò)敏病例急診，因此過(guò)敏病癥一直困擾大家[1]。過(guò)敏性較高可導(dǎo)致90%以上病例的八類(lèi)食物為蛋、牛乳、豆、花生、堅(jiān)果類(lèi)、甲殼類(lèi)動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)以及谷物[2]，其中引起這八大類(lèi)食物致敏的因素大多是蛋白質(zhì)類(lèi)、或能結(jié)合到蛋白質(zhì)上的化合物。雖然八大類(lèi)高致敏食物是威脅人類(lèi)健康的隱形殺手，但考慮到其本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及可觀的經(jīng)濟(jì)效益，調(diào)查中國(guó)主要致敏食物品種、識(shí)別其致敏蛋白，研究致敏機(jī)理進(jìn)而開(kāi)發(fā)低致敏或抗過(guò)敏食品就具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

1 食物致敏蛋白識(shí)別

1.1 植物性食物致敏蛋白

植物性食物蛋白中大豆，花生以及谷物等過(guò)敏原早已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，具體可分為種子貯藏蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和防御蛋白[3]。90年代，Ogawa等發(fā)現(xiàn)大豆主要過(guò)敏蛋白為Glym Bd30k，Glym Bd28k和β-7s伴大豆球蛋白[4]。2007年，劉曉毅通過(guò)PBS緩沖液提取蛋白、利用SDS-PAGE凝膠電泳、免疫印跡以及競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)得出非發(fā)酵性豆制品存在大量致敏蛋白，其中脂肪氧化酶和32.5 KDa致敏蛋白難被識(shí)別，β-7s伴大豆球蛋白存在非特異性吸附且是最主要的致敏蛋白[5]。

堅(jiān)果類(lèi)的過(guò)敏原以花生的研究較為充分。早在20年前，Sachs et al從花生原料中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)致敏蛋白并命名為Peanut-I之后[6]，國(guó)際上目前已采用IgE檢測(cè)的辦法識(shí)別出了7種致敏蛋白Ara h1—Ara h7[7]，其中Ara hl和Ara h2為主要致敏原。尤麗麗采用熱加工花生乳為原料與IgE特異性結(jié)合后得到分子量依次為31.3、29.5、23.8 kDa 三條性質(zhì)穩(wěn)定的區(qū)帶[8]。

Matsuda等運(yùn)用 HPLC、ELISA、SDS-PAGE及親和層析分離純化出大量存在于水稻胚乳中分子量為16、15.5、14 kDa的清蛋白，這3種蛋白是目前已知的水稻中最主要的過(guò)敏蛋白[9]。小麥過(guò)敏原表位多集中于分子量為 20、27、31、36、47 kDa 以及谷氨酰胺－谷氨酰胺－谷氨酰胺－脯氨酸－脯氨酸的（Gln－Gln－Gln－Pro－Pro）五肽結(jié)構(gòu)[10]。實(shí)驗(yàn)得出油料作物黑白兩種芝麻中質(zhì)量為11 kDa的蛋白為主要變應(yīng)原[11]。

1.2 動(dòng)物性食物致敏蛋白

牛乳蛋白中，乳清蛋白質(zhì)的β－乳球蛋白以及酪蛋白中的αs1－酪蛋白的過(guò)敏活性最高。雞蛋致敏蛋白主要存在于蛋清中，公認(rèn)的過(guò)敏成分為卵類(lèi)粘蛋白、卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶四種蛋白[12]。

動(dòng)物性食物致敏蛋白中海產(chǎn)品的研究始于20世紀(jì)中葉，自從Aas純化鑒定出鱈魚(yú)過(guò)敏成分為小清蛋白后，國(guó)內(nèi)外大量研究表明各種魚(yú)類(lèi)變應(yīng)原均為小清蛋白[13]。無(wú)論是鯉魚(yú)、鯖魚(yú)、金槍魚(yú)等常見(jiàn)家魚(yú)還是馬鲅、印度小公魚(yú)、鯧魚(yú)和卡瓦拉馬鮫四種熱帶魚(yú)，其致敏蛋白均為分子量為10 kDa～14 kDa，等電點(diǎn)為3.9～5.5的鈣結(jié)合小清蛋白并且主要存在于魚(yú)肉的肌漿蛋白部分[14]。

采用SDS－PAGE凝膠電泳、免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等方法對(duì)純化甲殼類(lèi)蝦、蟹蛋白識(shí)別得到分子質(zhì)量依次約為200、175、116、85和36 kDa的原肌球蛋白[15]。

軟體類(lèi)魷魚(yú)過(guò)敏蛋白是具有熱穩(wěn)定性的Tod p 1，38 kDa，鮑魚(yú)則是約34 kDa的Hal d 1原肌球蛋白[16]。

1.3 食品添加劑

食品添加劑引起的過(guò)敏反應(yīng)通常為非IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，部分人群對(duì)防腐劑、色素、抗氧化劑發(fā)生如蕁麻疹和血管性腫脹等過(guò)敏現(xiàn)象[17]。

1.4 轉(zhuǎn)基因食品

很多轉(zhuǎn)基因食品使用過(guò)敏性未知的微生物作為基因供體，來(lái)自非食品源的基因和新的基因結(jié)合體就能夠在一些植物或動(dòng)物受體中引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，或者使已存在的過(guò)敏反應(yīng)加劇[18]。

2 食物過(guò)敏蛋白致敏機(jī)理

變態(tài)反應(yīng)按照發(fā)生機(jī)制習(xí)慣上被學(xué)者分為I－IV型，食物過(guò)敏屬于I型即時(shí)性過(guò)敏。食品過(guò)敏的主要效應(yīng)為IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括致敏和發(fā)敏兩個(gè)階段。一定量的過(guò)敏原刺激易感個(gè)體產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE通過(guò)血循環(huán)分布全身，并與肥大細(xì)胞（MastceH，MC）、嗜堿性粒細(xì)胞（Basophil，Bas）膜表面特定的受體結(jié)合，從而使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸含相同或相似過(guò)敏原成分的食品時(shí)，過(guò)敏原分子與IgE發(fā)生“橋聯(lián)”，誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等一系列炎癥介質(zhì)而觸發(fā)食物過(guò)敏癥[19]。

2.1 食物抗原決定簇

任何食物僅有部分變應(yīng)原誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，這部分抗原決定基被稱為“表位”。過(guò)敏原含有兩類(lèi)抗原決定簇，T細(xì)胞抗原決定簇和B細(xì)胞抗原決定簇。一般T細(xì)胞抗原決定簇是線性表位，比較穩(wěn)定。B細(xì)胞表位是分子內(nèi)不連續(xù)的2～3個(gè)氨基酸殘基折疊排列成的三維構(gòu)象表位[20]。今后針對(duì)食物抗原決定簇線性作用表位以及影響IgE結(jié)合能力的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行研究，開(kāi)展過(guò)敏原線性抗原表位以及立體抗原表位的探索，從分子水平為致敏機(jī)理提供理論依據(jù)。

通過(guò)Fmoc固相肽合成法逐步縮合成肽端、藕聯(lián)直至達(dá)到目的基因建立致敏蛋白肽圖譜，確定其抗原決定簇。在此基礎(chǔ)上基于Fmoc固相肽合成法，對(duì)于致敏蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變，確定關(guān)鍵氨基酸調(diào)控位點(diǎn)。并以計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)模擬蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型，從二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)確立其抗原決定簇。從分子學(xué)水平，線性表位和空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合，計(jì)算機(jī)技術(shù)輔助闡明其致敏機(jī)理。

分子水平上以單一蛋白為研究對(duì)象利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、圓二色譜、ANS熒光探針和紫外光譜等檢測(cè)方法，系統(tǒng)研究熱加工對(duì)花生過(guò)敏原Ara h 2抗原性和結(jié)構(gòu)的影響以及花生蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變后蛋白中已存在表位的破壞程度，從而進(jìn)一步探討其抗原變化機(jī)理[21]。

2.2 過(guò)敏原交叉反應(yīng)性

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多種過(guò)敏原與其他同類(lèi)或不同類(lèi)的過(guò)敏原具有交叉反應(yīng)性，這可能是由于不同蛋白質(zhì)有共同的抗原決定簇所造成?，F(xiàn)實(shí)生活中，同一屬不同目的魚(yú)小清蛋白較高的同源性使得免疫交叉反應(yīng)存在。Thien對(duì)九種常見(jiàn)市售魚(yú)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鱈魚(yú)、鮭魚(yú)、青魚(yú)、雷公魚(yú)具有嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，而比目魚(yú)、金槍魚(yú)則免疫性較弱[22]。某種程度上，了解各種過(guò)敏原交叉反應(yīng)性發(fā)生原因往往會(huì)指導(dǎo)致敏機(jī)制的研究?；ㄉ^(guò)敏原Ara h2和Ara h6的生物信息學(xué)比較研究發(fā)現(xiàn)以Ara h6為模板同源建?？梢缘玫紸ra h2的立體結(jié)構(gòu)，Ara h2和Ara h6的一級(jí)結(jié)構(gòu)到三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似，為交叉免疫奠定分子基礎(chǔ)從而研究花生過(guò)敏機(jī)制[23]。

2.3 過(guò)敏原生物學(xué)特性

在研究蛋白致敏機(jī)制時(shí)，大量的致敏蛋白被證實(shí)是糖蛋白，例如小麥粉蛋白、大米致敏蛋白和大豆中的Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K蛋白。隨著蛋白致敏機(jī)制的探索深入，此理論并不確鑿。劉曉毅選擇N－端糖苷酶作用富含糖鏈且是主要致敏原的7S球蛋白，通過(guò)免疫印跡研究脫糖鏈前后蛋白致敏性的變化情況[24]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到7s球蛋白3個(gè)亞基均是糖蛋白，但是它們?cè)谔擒彰傅乃庾饔弥笠廊豢梢耘c患者血清IgE結(jié)合，所以糖鏈并非IgE結(jié)合的決定集團(tuán)。

3 食物蛋白脫敏研究現(xiàn)狀

常見(jiàn)的八大類(lèi)過(guò)敏原具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以預(yù)防過(guò)敏癥的最佳方法不是禁止攝入此類(lèi)食物，而是選擇改良脫敏技術(shù)。目前食物蛋白脫敏技術(shù)大致分為三類(lèi)：物理化學(xué)方法、酶法、生物技術(shù)方法。

3.1 物理化學(xué)方法

3.1.1 超高壓技術(shù)

超高壓可以改變分子間和分子內(nèi)的非共價(jià)作用力，生物高分子物質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵結(jié)合產(chǎn)生影響后，食物致敏性可能得到降低。曾有文獻(xiàn)報(bào)道用超高壓生產(chǎn)低過(guò)敏性的乳清蛋白制品。然而將純化凍干的蝦過(guò)敏蛋白裝于超高壓帶中設(shè)定壓強(qiáng)為100 MPa～500 MPa，分子量并未發(fā)生變化，原肌球蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有解聚生成小顆粒亞基單位[25]。濃度2%的大豆蛋白溶液在自制高壓靜電場(chǎng)－30 KV、場(chǎng)直徑147 mm的處理下致敏蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化，抗原空間表位沒(méi)有受到破壞，所以高壓靜電場(chǎng)作用不一定能夠達(dá)到脫敏的效果[26]。

3.1.2 熱處理技術(shù)

高溫會(huì)引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象及三維結(jié)構(gòu)的變化。因此食物加熱到一定程度可以降低致敏性或去除過(guò)敏原。鯇魚(yú)蛋白與IgE結(jié)合的陽(yáng)性帶主要有5條（51，39，27，23，10 kDa），隨溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)、印跡條帶逐漸減少到完全消失，說(shuō)明加熱一定程度可以去除過(guò)敏原的致敏活性[27]。

3.1.3 其他方法

Lee[28]等采用γ射線對(duì)雞蛋白進(jìn)行處理，結(jié)果表明在10 kGy的劑量下，致敏性卵白蛋白的含量減少了96%。說(shuō)明輻照可以破壞過(guò)敏原空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致致敏性降低。蝦過(guò)敏蛋白在849 W、35℃作用15 min，849 W、50℃作用15 min，999 W、100℃微波作用2 h后蛋白質(zhì)分子量沒(méi)有任何變化[29]。

3.2 酶法

抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等改變，使之失去原有的活性，也可通過(guò)斷裂酰胺鍵降低過(guò)敏原的分子量來(lái)減弱其致敏性[30]。

酶法改性蛋白分為酶法水解蛋白技術(shù)和酶法交聯(lián)技術(shù)。董曉穎用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等五種酶在相同酶活下測(cè)定致敏蛋白水解能力，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶在加酶量為1 000 U/g，pH 8.0、溫度為60℃水解4 h后抑制率最大近似為0，致敏性完全消失[29]。胃蛋白酶和胰蛋白酶作用鯉魚(yú)進(jìn)行體外模擬消化過(guò)程后在半小時(shí)內(nèi)膠原蛋白含量明顯降解[30]，胃蛋白酶作用鯇魚(yú)后分子量為 65，55，39，27 kDa 蛋白消失而 37 kDa 卻依然頑固不變[31]。

酶法交聯(lián)是通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶使蛋白質(zhì)聚集，使原先暴露在表面的過(guò)敏原表位包埋入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而消除其過(guò)敏原性。Chung等發(fā)現(xiàn)在37℃，pH8的環(huán)境下，用過(guò)氧化物酶處理烘烤花生60 min后花生中主要過(guò)敏原Ara h 1和Ara h 2減少的同時(shí)與IgE的結(jié)合能力減弱，這可能是由于致敏蛋白上的結(jié)合部位生成多聚體而被掩蔽[32]。

3.3 生物技術(shù)方法

3.3.1 發(fā)酵法

建立發(fā)酵過(guò)程是改善食品致敏特性的新思路，有待成為食品蛋白質(zhì)脫敏過(guò)程的一項(xiàng)新型技術(shù)。胡曉萍向100 ml含有2%大豆蛋白、2%葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基中接種107個(gè)/100 mL雅致放射毛霉、米曲霉、少孢根霉以及少根根霉后致敏性均下降60%以上[33]。

3.3.2 基因工程法

美國(guó)科學(xué)家在上個(gè)世紀(jì)90年代就利用生物技術(shù)將大豆中過(guò)敏蛋白的基因去除，這項(xiàng)將蛋白中主要過(guò)敏原從食物中脫除的技術(shù)在人類(lèi)歷史上尚屬首次。轉(zhuǎn)基因引發(fā)過(guò)敏性風(fēng)險(xiǎn)上升的同時(shí)需要逆向考慮此項(xiàng)技術(shù)可以減少食物中過(guò)敏蛋白。目前已報(bào)道兩種方法：反義基因和共抑制技術(shù)抑制基因表達(dá)[34]。

3.4 展望

3.4.1 低過(guò)敏及抗過(guò)敏食品開(kāi)發(fā)

食物過(guò)敏嚴(yán)重影響部分人群的生活質(zhì)量，目前尚無(wú)特效療法。只有對(duì)食品進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究以尋找新途徑消除或降低食物中的過(guò)敏原活性，上述脫敏技術(shù)以及n－6和n－3系多價(jià)不飽和脂肪酸、多酚類(lèi)等抗過(guò)敏因子的應(yīng)用即可達(dá)到低過(guò)敏和抗過(guò)敏食品的開(kāi)發(fā)。

劉曉毅采用分離和酶解兩步工藝專一性去除大豆主要致敏蛋白中7s球蛋白中的α亞基獲得低致敏大豆制品[35]。汪寧對(duì)沙丁魚(yú)、金槍魚(yú)和鯖魚(yú)漂洗加工后制成魚(yú)糜制品，過(guò)敏原含量有很大程度的降低；另外對(duì)3種魚(yú)罐頭進(jìn)行免疫印跡，均未能檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的特異性條帶[36]。所以魚(yú)糜和高溫高壓的魚(yú)罐頭都可以被認(rèn)為是低致敏性食物。

3.4.2 過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)

防治過(guò)敏尤為重要的是低過(guò)敏食品的大力研發(fā)以及食物過(guò)敏源快速有效檢測(cè)的方法開(kāi)發(fā)。

臨床上診斷致敏原是否激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)包括皮膚針刺試驗(yàn)、排除性膳食實(shí)驗(yàn)、血清特異性IgE水平測(cè)定和食物刺激實(shí)驗(yàn)（開(kāi)放和雙盲對(duì)照）；而檢測(cè)蛋白質(zhì)殘余與降解情況則對(duì)體外熱穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[37]。開(kāi)發(fā)高通量靈敏的抗過(guò)敏食品安全檢測(cè)手段包括免疫微陣列、蛋白質(zhì)芯片、生物傳感結(jié)合特異性IgE 檢測(cè)[38]。

4 結(jié)語(yǔ)

食物過(guò)敏威脅兒童健康、影響成人生活，是食品安全事件中不可避免的問(wèn)題。在國(guó)內(nèi)外食品來(lái)源多樣化的今天，大量科研工作者已經(jīng)開(kāi)展對(duì)食物中過(guò)敏成分的深入研究。由于食物過(guò)敏不可逆轉(zhuǎn)并且難以根治，因此，摸索食物過(guò)敏機(jī)制以研發(fā)低過(guò)敏食品就成為我們當(dāng)今科研課題中的重中之重。

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