史曉飛，王　可，樊琳琳，馬　新，付建斌

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，洛陽 471003)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的病原體識別受體，通過識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)誘導免疫效應分子表達，激活多種前炎性因子參與抗感染過程。新近研究認為，TLRs與其相應的特異性配體(包括內(nèi)源和外源性配體)結(jié)合，參與并調(diào)控特異性免疫應答過程，在天然免疫和特異性免疫之間架起橋梁。因此，TLRs在自身免疫性疾病中的作用逐漸受到重視。家族成員Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)能夠特異性識別內(nèi)源或外源DNA中非甲基化的CpG-DNA基序，啟動炎性應答信號通路，誘導自身抗體、炎性分子產(chǎn)生，引發(fā)炎性反應和免疫效應，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用，近2年也成為研究熱點[1]。SLE是以自身反應性T、B細胞異?；罨?、產(chǎn)生致病性自身抗體和免疫復合物為主要特征的一種慢性炎性自身免疫病，病情復雜且診治困難，本文旨在通過了解TLR9表達與SLE臨床特點的相關(guān)性，以期為TLR9用于疾病臨床診斷和病情監(jiān)測提供理論依據(jù)。

對象和方法

對象

河南科技大學第一附屬醫(yī)院2009年12月至2011年3月門診和住院SLE患者48例，診斷符合1987年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)診斷標準，并根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)評分標準，分為SLE活動期組(≥10分)和SLE非活動期組(<10分)。

疾病對照組36例，包括類風濕關(guān)節(jié)炎15例，干燥綜合征12例，系統(tǒng)性硬化癥4例，肌炎皮肌炎5例。診斷均符合國際診斷標準，并排除合并感染、腫瘤等患者。

健康對照組為25名來自體檢中心的健康體檢者，抽血前1個月內(nèi)無感染史。

方法

細胞內(nèi)流式細胞術(shù)檢測外周血CD19+B淋巴細胞TLR9表達：(1)每例標本取3支流式上樣管分別標記A、B、C，各加入100 μl抗凝全血；A、B管加入PE標記的鼠抗人CD19單克隆抗體(美國BD公司)，C管為空白對照，混勻、孵育。(2)加入紅細胞裂解液，混勻、孵育，離心、棄上清，PBS清洗。(3)加入預冷(4℃)固定液(Fix&Perm1，美國eBioscience公司)，孵育，PBS清洗。(4)加入破膜劑(Fix&Perm2)，輕微震蕩，孵育，PBS清洗。(5)A管加鼠抗人TLR9單克隆抗體(濃度5μgml，美國ALEXIS公司)，B管加入Mouse IgG1同型對照(美國ALEXIS公司)，混勻、孵育；C管加入0.5 ml PBS液重懸細胞，待測；A、B管PBS清洗，加羊抗鼠FITC熒光標記Ⅱ抗(美國BD公司)，混勻、孵育；PBS清洗，加入0.5 ml PBS液重懸細胞，與C管同上機檢測分析。(6)應用流式細胞儀FASCan進行檢測，利用前向散射光和側(cè)向散射光以B淋巴細胞設門，對PE標記的CD19細胞中結(jié)合FITC標記的TLR9細胞進行檢測，測定每樣本門內(nèi)20 000個細胞；檢測結(jié)果用Cell Quest軟件進行分析，記錄CD19+細胞TLR9陽性細胞表達率。

血、尿常規(guī)、24 h尿蛋白定量、補體C3、紅細胞沉降率、抗雙鏈DNA抗體滴度測定等實驗室資料采集按照我院常規(guī)方法測定。根據(jù)患者抽血前10 d內(nèi)出現(xiàn)的臨床癥狀和實驗室檢查結(jié)果，對SLE患者疾病活動情況以SLEDAI評分標準量化評分。

統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一般情況

SLE活動期組27例，女25例，男2例，年齡為16～50歲，平均(30.2±8.9)歲。SLE非活動期組21例，女19例，男2例，年齡為20～53歲，平均(32.1±9.6)歲。SLE活動期組初發(fā)者15例，未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；復發(fā)者12例，抽血前潑尼松用量≤30 mgd，用藥時間≤1個月。

疾病對照組36例，女30例，男6例，年齡為21～58歲，平均(34.1±8.5)歲。健康對照組25名，年齡為19～55歲，平均(29.4±7.9)歲。

CD19+B淋巴細胞TLR9表達

SLE活動期組外周血CD19+B細胞TLR9表達率高于非活動期組、疾病對照組及健康對照組(均P<0.01)。SLE非活動期組和疾病對照組CD19+B細胞TLR9表達率雖高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。SLE非活動期組與疾病對照組CD19+B細胞TLR9表達率相似，差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

糖皮質(zhì)激素對SLE患者CD19+B細胞TLR9表達率的影響

SLE活動期組中已用糖皮質(zhì)激素治療者外周血CD19+B細胞較未用藥者下降(P<0.05)，而應用中小劑量糖皮質(zhì)激素對TLR9在CD19+B細胞的表達無顯著差異(P>0.05)(表2)。

CD19+B淋巴細胞TLR9表達與臨床指標的相關(guān)性

SLE患者外周血CD19+B細胞內(nèi)TLR9表達率與SLEDAI評分(r=0.763)、抗雙鏈DNA抗體滴度(r=0.781)、紅細胞沉降率(r=0.712)呈正相關(guān)(均P<0.01)；與24 h尿蛋白(r=0.186)及血清補體C3水平無明顯相關(guān)(r=-0.326)(均P>0.05)。

表1外周血CD19+B細胞TLR9表達率

組　別例數(shù)CD19+B細胞TLR9表達率(%)SLE活動期組2754 18±17 97?SLE非活動期組2132 97±9 85疾病對照組3630 88±9 12健康對照組2529 75±7 49

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；TLR9：Toll樣受體9；*與SLE非活動期組、疾病對照組、健康對照組比較，均P<0.01

表2SLE活動期患者應用糖皮質(zhì)激素對CD19+B細胞TLR9表達率的影響

SLE活動組例數(shù)CD19+B細胞CD19+B細胞TLR9表達率未用糖皮質(zhì)激素157 72±4 3259 78±20 84已用糖皮質(zhì)激素124 01±3 7946 98±14 22t—2 341 81P—0 0280 082

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；TLR9：Toll樣受體9

討　　論

迄今為止已發(fā)現(xiàn)10余種TLRs家族成員及其特異的TLR配體，不同成員在RA、干燥綜合征、硬皮病等自身免疫病中得到不同關(guān)注。其中TLR9因識別內(nèi)源或外源非甲基化CpG-DNA序列啟動炎性應答信號通路、激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1最終導致自身反應性T、B細胞活化，并誘導自身抗體和炎性分子產(chǎn)生，在SLE中的作用也受到越來越多的重視。

新近觀點提出，B細胞可以不依賴T細胞直接由免疫復合物(immune complex，IC)通過TLRs途徑激活參與自身免疫疾病的發(fā)病過程[2]，因此推測TLR9可能參與了SLE的發(fā)病過程。Leadbetter等[3]發(fā)現(xiàn)從MRL(lprlpr)狼瘡鼠模型中分離出來的B細胞經(jīng)包含CpG-DNA的IgG型IC刺激后能夠產(chǎn)生大量自身抗體，而這一過程需要B細胞抗原受體和細胞內(nèi)TLR9的協(xié)同作用。這一機制也能夠解釋Anders等[4]在MRL(lprlpr)狼瘡鼠活體實驗中應用細菌CpG-DNA處理后，可以導致狼瘡鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量DNA自身抗體的現(xiàn)象。越來越多的資料顯示，TLR9的銜接作用可能是SLE中B細胞活化及自身抗體產(chǎn)生的新的潛在機制[5]。

本實驗利用細胞內(nèi)流式細胞技術(shù)檢測了TLR9在SLE患者、非SLE的結(jié)締組織病患者及健康人外周血CD19+B淋巴細胞的表達水平，并探討SLE患者疾病活動狀態(tài)下外周血B細胞TLR9表達率情況。結(jié)果顯示，SLE病情活動期TLR9表達顯著升高，提示B淋巴細胞內(nèi)TLR9的激活與SLE及臨床病情活動存在一定聯(lián)系。根據(jù)以往研究推測，SLE患者機體的免疫和炎性反應都存在明顯異常，尤其是在病情活動期，體內(nèi)出現(xiàn)高滴度自身抗體和大量免疫復合物[6]，從而提供更多促使TLR9途徑激活的CpG-DNA配體，并通過前述機制進一步促進細胞因子產(chǎn)生與免疫細胞(包括自身反應B細胞)分化成熟，分泌自身抗體和形成IC。因此，TLR9表達隨著疾病活動度增高而上調(diào)，且其表達增高也反映出B細胞處于高度活化狀態(tài)。同時，這一機制也能夠解釋外源性感染容易誘發(fā)SLE活動的現(xiàn)象[7]，可能與細菌或病毒DNA侵入激活TLR9途徑有關(guān)。目前國內(nèi)外對于外周血B細胞TLR9表達情況尚存在爭議，Kiyoshi等[8]利用流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)B細胞TLR9在SLE患者表達上調(diào)，結(jié)果與本研究相似。李守新等[9]檢測外周血單個核細胞TLR9 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，SLE患者較健康人表達降低，但這是基于TLR9轉(zhuǎn)錄水平的檢測，不等同于TLR9在蛋白水平的表達情況。

SLEDAI評分及抗雙鏈DNA抗體滴度等都是SLE疾病活動性評定的常用指標，對判斷疾病預后及臨床治療都具有較好的指導作用。本實驗結(jié)果顯示，TLR9的表達與兩者均具有正相關(guān)性，再次證實TLR9表達與SLE疾病活動存在一定聯(lián)系；而其與補體C3水平無明顯相關(guān)性，可能是TLR9不影響補體系統(tǒng)激活途徑或者與樣本量有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者應用小劑量糖皮質(zhì)激素對外周血B細胞TLR9表達無明顯影響，其原因尚不清楚。雖然糖皮質(zhì)激素具有較強的抗炎和免疫抑制作用，且能夠通過抑制NF-κB所引起的一系列免疫和炎性反應而發(fā)揮作用，但其作用機制廣泛且復雜，同時這些作用也隨劑量不同而異[10-11]。因此，是否由于劑量不足出現(xiàn)此現(xiàn)象，或者作為阻斷TLR9下游信號方式并不影響TLR9本身的表達，這些都還有待進一步研究觀察。

綜上所述，TLR9介導的信號轉(zhuǎn)導途徑參與SLE的發(fā)生發(fā)展過程，可能與疾病活動、器官功能損害等臨床特點存在一定相關(guān)性，因此可以通過外周B細胞TLR9的表達情況作為判斷SLE患者疾病活動性及臨床預后的指標之一。

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