王 瑛，張本印，牛江進，張 琳，陶燕鐸，梅麗娟，王啟蘭，*

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧 810008；2.中國科學院研究生院，北京 100049）

乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）屬菊科香青屬多年生草本植物，主要分布于青海東部、甘肅南部及四川西北部，為常用藏藥，全草用藥，具有活血散瘀、祛風濕、消痞瘤、平肝潛陽、祛痰、平喘及外用止血、治風寒感冒、胃潰瘍等功效[1-4]。綠原酸是乳白香青中主要的生物活性物質(zhì)之一，化學名稱為3-咖啡?？崴幔肿邮綖镃16H18O9[5]。綠原酸具有較強的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化[6-8]、抗病毒[9]、消炎[10]、解毒、利膽、降壓降血脂和升高白細胞及顯著增加胃腸蠕動和促進胃液分泌等藥理作用[11-13]，對大腸桿菌、金色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有較強的抑制作用[14-15]。綠原酸作為極具生物活性的天然物質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化等行業(yè)。我國雖然擁有富含綠原酸的金花、杜仲等豐富的自然資源，國內(nèi)外對綠原酸的需求仍然較大。但截至目前，國內(nèi)外文獻還沒有對乳白香青中綠原酸提取工藝研究報道。鑒于響應(yīng)面法在優(yōu)化反應(yīng)條件、研究各因素之間相互作用的過程中具有直觀、簡便的特點，如張崟等[16]就響應(yīng)面法與正交實驗對骨素酶解工藝做了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法得出的最優(yōu)工藝所得的水解度比正交實驗得出的最優(yōu)工藝所得水解度高出15.4%。將響應(yīng)面法用于乳白香青綠原酸提取工藝的優(yōu)化和結(jié)果分析，對開發(fā)和利用乳白香青資源有重要意義。本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上選擇提取溫度、液料比、甲醇百分含量3個主要因素，用綠原酸標準品HPLC法繪制標準曲線，以綠原酸得率為指標，采用響應(yīng)面法對乳白香青中綠原酸提取工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳白香青 2011年8月采自青海省門源縣仙米林場（N37°23’～37°50’，E101°46’～102°39’之間），經(jīng)中國科學院西北高原生研究所梅麗娟高級工程師鑒定為乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）；綠原酸標準品 購自中國藥品生物制品檢定所；試劑 除高效色譜流動相用色譜純外，其余均為分析純；色譜用水 超純水。

Agilent 1200型液相色譜儀 美國安捷倫儀器有限公司；XS105DU型電子天平 瑞士梅特勒托利多；DFY－300型高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；UPT－Ⅰ－57型優(yōu)普超純水機 成都超純水科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 將乳白香青置于通風避光處陰干至恒重，用中藥粉碎機粉碎成細粉，過八十目篩，備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Phenomenex ODS（150.0mm×4.6mm，35μm）色譜柱；流動相為乙腈－0.3%磷酸（13∶87，V/V）；檢測波長為327nm；柱溫為25℃；流速為1.0mL/min；進樣量為10μL。

1.2.3 綠原酸標準曲線的繪制 精密稱取綠原酸對照品2.4mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得0.24mg/mL的對照品儲備液。在液相中綠原酸標準品進樣量分別為5、8、10μL，以綠原酸標準品的質(zhì)量為縱坐標，以峰面積為橫坐標繪制標準曲線。計算得線性回歸方程為：y=0.0004x－0.0088，r=0.9998，如圖1所示。結(jié)果表明，峰面積與綠原酸標準品的質(zhì)量線性關(guān)系良好。綠原酸對照品色譜圖及乳白香青樣品色譜圖如圖2所示。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計 在進行響應(yīng)面分析之前，先通過單因素實驗選出對乳白香青綠原酸提取得率有影響的因素，并確定其實驗水平。參考相關(guān)文獻，本文稱取1.00g乳白香青粉末，考察了不同的液料比（10∶1～50∶1）、提取溫度（30～90℃）、甲醇提取濃度（45～95%）、超聲時間（5～30min）對綠原酸提取得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析方法 根據(jù)Box－Benhnken實驗設(shè)計原理，選擇影響乳白香青綠原酸得率（Y）的3個主要影響因素：提取溫度（A）、液料比（B）、甲醇濃度（C）進行組合。以－1、0、1代表自變量水平，xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實值；其關(guān)系為xi=（Xi－X0）/ΔX。其中，X0為實驗中心點處自變量的真實值；ΔX為自變量的變化步長[17]。實驗因素及水平編碼見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對綠原酸提取率的影響 設(shè)定甲醇濃度為70%，提取溫度為50℃，考察液料比對綠原酸提取率的影響。設(shè)計液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。結(jié)果如圖3所示。當料液比為30∶1時，綠原酸提取得率基本不再增加。再增加液料比，綠原酸提取得率基本穩(wěn)定，但同時會增加生產(chǎn)成本。

2.1.2 提取溫度對綠原酸提取率的影響 設(shè)定液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)為70%，考察提取溫度對綠原酸提取率的影響。設(shè)計提取溫度為30、40、50、60、70、80、90℃。結(jié)果如圖4所示，綠原酸提取率溫度升高而增加，當溫度升高至時40℃，綠原酸提取得率最高；40～60℃時綠原酸提取率平穩(wěn)；隨后提取率急劇降低。

2.1.3 甲醇濃度對乳白香青中綠原酸提取率的影響設(shè)定液料比20∶1，提取溫度50℃，考察甲醇濃度對綠原酸提取率的影響。設(shè)計甲醇體積分數(shù)為45%、55%、65%、75%、85%、95%，結(jié)果如圖5所示。綠原酸提取率隨甲醇濃度增加而增加，當甲醇體積分數(shù)為65%時，綠原酸提取率最高，甲醇濃度大于65%時，綠原酸提取得率下降。

2.2 響應(yīng)面法實驗數(shù)據(jù)分析

對乳白香青中綠原酸提取工藝進行響應(yīng)面分析，其具體實驗方案及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

采用Design-Expert 8.05軟件對各因素進行回歸擬合，得到綠原酸得率回歸方程：

Y=5.26+0.18A+0.38B+0.17C+0.094AB+0.13AC+0.23BC-0.46A2-0.54B2-0.48C2-0.080A2B。

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察（見表3）。結(jié)果表明對綠原酸提取量所建立的二次多項模型具有顯著性。因而該模型擬合程度比較好，實驗誤差小，可以用此模型對甲醇提取乳白香青中綠原酸的提取量進行分析和預測。模型方程回歸系數(shù)及其顯著性檢驗（見表3）。結(jié)果表明，一次項A、C顯著，B極顯著；二次項A2、B2和C2極顯著；交互項AB、AC不顯著，BC顯著。

2.3 響應(yīng)面分析和因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制乳白香青綠原酸的響應(yīng)面圖，可直觀地看出響應(yīng)面的最高點，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對響應(yīng)值的影響，依次可以確定最佳工藝參數(shù)范圍。Design-Expert 8.05軟件處理后三維響應(yīng)面圖見圖6。

通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖，可直觀地描述各因素對響應(yīng)值（綠原酸含量）的影響和各個因素間的交互作用。由圖6可以看出，響應(yīng)曲面均是開口向下的凸面，等高線近似為圓形，其中心位于所考察區(qū)域內(nèi)，說明在考察的區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極大值，同時響應(yīng)面為突出的曲面，即簡單的一次線性方程難以解析。

通過Design-Expert 8.05軟件分析各因素對乳白香青中綠原酸得率的影響得出結(jié)論，甲醇提取乳白香青綠原酸的最佳條件為提取溫度41.33℃、甲醇濃度66.33%和液料比31.33∶1。在此條件下綠原酸提取量可達5.3295mg/g。為檢驗響應(yīng)面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行乳白香青中綠原酸甲醇提取實驗，同時考慮到實際操作的情況，將乳白香青綠原酸最佳提取條件修正為提取溫度41℃、甲醇濃度66%、液料比31∶1，實際測得的綠原酸含量為5.2796mg/g，與理論預測值基本吻合。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的乳白香青中綠原酸甲醇提取工藝參數(shù)基本準確可靠，具有一定的實用價值。

3 結(jié)論與討論

乳白香青成分復雜，采用紫外分光光度法測定[18]時雜質(zhì)干擾嚴重，無法對其活性成分綠原酸進行定量分析。本實驗參考文獻[19]采用HPLC法并進行優(yōu)化，以乙睛-0.3%磷酸溶液（13∶87）為流動相，分離度好、重現(xiàn)性好、操作簡便、數(shù)據(jù)可靠，可用于乳白香青中綠原酸含量的質(zhì)量控制。

本文在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對乳白香青綠原酸提取工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，各因素指標之間的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。從本次實驗數(shù)據(jù)所繪制的曲面圖可以看出，提取溫度、液料比、甲醇濃度3個因素對乳白香青中綠原酸成分提取率的效應(yīng)趨勢，液料比對考察指標影響較大，提取溫度與提取濃度對考察指標的影響較小。通過回歸方程優(yōu)化得乳白香青中綠原酸的最佳提取工藝為：提取溫度41℃，料液比31∶1，甲醇濃度為66%，此條件下乳白香青中綠原酸平均提取得率為5.2796mg/g，高于優(yōu)化前的提取率3.8356mg/g。響應(yīng)面法優(yōu)化乳白香青中綠原酸提取率比優(yōu)化前提高了27.40%?；貧w分析和驗證實驗結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化乳白香青中綠原酸的提取工藝條件，得到的綠原酸提取工藝流程具有實際應(yīng)用價值。

[1]羅達尚.中華藏本草[M].北京：民族出版社，1997.

[2]中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1996.

[3]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（32）卷[M].北京：科學出版社，1999.

[4]袁彥平，劉兆平，金東慶.乳白香青治療氣管炎的動物實驗研究[J].中國比較醫(yī)學雜志，2004，14（6）：388.

[5]Chun O K，Kim D-O.Consideration on equivalent chemicals in total phenolic assay of chlorogenic acid-rich plums[J].Food Research International，2004，37：337-342.

[6]Padda M S，Picha D H.Quantification of phenolic acids and antioxidant activity in sweetpotato genotypes[J].Scientia Horticulturae，2008，119（1）：17-20.

[7]Sato Y，Itagaki S，Kurokawa T，et al.In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid[J].International Journal of Pharmaceutics，2011，403：136-138.

[8]Xiang Z N，Ning Z X.Scavenging and antioxidant properties of compound derived from chlorogenic acid in South-China honeysuckle[J].LWT，2008，41：1189-1203.

[9]Wang G F，Shi L P，Ren Y D，et al.Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid，quinic acid and caffeic acid in vivo and in vitro[J].Antiviral Research，2009，83：186-190.

[10]Han T， Li H L， Zhang Q Y， et al.Bioactivity-guided fractionation for anti-inflammatory and analgesic properties and constituents of Xanthium strumarium L.[J].Phytomedicine，2007，14：825-829.

[11]Cho A S， Jeon S M， Kim M J， et al.Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fatdiet-induced-obese mice[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48：937-943.

[12]Pietraforte D，Castelli M，Metere A，et al.Salivary uric acid at the acidic pH of the stomach is the principal defense against nitrite-derived reactive species：Sparing effects of chlorogenic acid and serum albumin[J].Free Radical Biology&Medicine，2006，41：1753-1763.

[13]Park S，Hahm K B，Oh T Y，et al.Preventive effect of the flavonoid，wogonin，against ethanol-induced gastric mucosal damage in rats[J].Digestive Diseases and Sciences，2004，49（3）：384-394.

[14]梅林，劉凌云，程正學，等.金銀花及其制劑含藥血清中綠原酸HPLC紫外光譜測定和抑菌活性研究[J].激光雜志，2007，28（4）：95-96.

[15]Zhao MM，Wang HY，Yang B，et al.Identification of cyclodextrin inclusion complex of chlorogenic acid and its antimicrobial activity[J].Food Chemistry，2010，120：1138-1142.

[16]張崟，王衛(wèi)，張佳敏，等.響應(yīng)面法和正交實驗對骨素酶解工藝優(yōu)化的比較[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（7）：53-56.

[17]王燕，羅文謙，張志琪，等.響應(yīng)表面優(yōu)化法及其在天然產(chǎn)物成分提取中的應(yīng)用[J].安康學院學報，2009，21（1）：77-81.

[18]鐘方曉.高效液相及紫外分光光度法測定金銀花中綠原酸和異綠原酸含量方法學比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16（3）：212.

[19]于俊林，孫仁爽，呂紅，等.金銀忍冬和黃花忍冬花及花蕾中綠原酸的HPLC法測定[J].中草藥，2008，39（11）：1738-1739.