夏 嬙，趙啟鳳，廖 業(yè)，朱 偉，喻國(guó)輝，陳遠(yuǎn)鳳，宋明英

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041;2.珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，珠海 519075)

昆蟲(chóng)抗菌肽因具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性強(qiáng)、無(wú)免疫原性、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性及毒副作用小，對(duì)寄主細(xì)胞無(wú)不良影響等優(yōu)點(diǎn) (Boman and Hultmark，1987)，成為當(dāng)今牧畜業(yè)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn) (國(guó)果等，2012;雷岷等，2012;金小寶等，2012)。

黑水虻Hermetia illucens L.是一種全世界廣泛分布的重要資源昆蟲(chóng) (喻國(guó)輝等，2009)。其幼蟲(chóng)生活環(huán)境與家蠅相似，以動(dòng)物糞便、腐爛的有機(jī)物及植物性垃圾為食。研究表明，黑水虻幼蟲(chóng)取食糞便后不僅可以減少糞便臭氣，還可使雞糞中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的量顯著降低 (Erickson et al.，2004)，有效控制奶牛糞便中大腸桿菌ER2566的生長(zhǎng) (Myers et al.，2008)。另外，黑水虻幼蟲(chóng)還能在體內(nèi)消化多種病原微生物，如霍亂、瘧疾病原物等。黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)雞糞中家蠅Musa domestica控制率達(dá)到100%，對(duì)小家蠅 Fannia canicularis的控制率達(dá)到99.9% (Tomberlin and Sheppard，2002)。因而，我們初步推斷黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)可能有比家蠅、黃粉蟲(chóng)等昆蟲(chóng)更強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)才有如此功能。另外，與家蠅等昆蟲(chóng)相比黑水虻有諸多優(yōu)點(diǎn)適于抗菌肽的研究，如黑水虻成蟲(chóng)不取食，交配產(chǎn)卵后即死亡 (王付彬等，2010)對(duì)環(huán)境無(wú)污染、不傳播疾病;化蛹前有遷移特性 (安新城等，2010)可主動(dòng)移出所飼養(yǎng)環(huán)境;各個(gè)發(fā)育階段蟲(chóng)體均較大，有利于抗菌肽的大量提取。所以，黑水虻是研究抗菌肽的優(yōu)良材料，是藥物研發(fā)的良好素材，但目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)其抗菌肽方面的研究。

本文采用菌液注射誘導(dǎo)法、菌液針刺浸泡誘導(dǎo)法、超聲波誘導(dǎo)法以不同誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑量誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽，優(yōu)化黑水虻幼蟲(chóng)抗菌肽誘導(dǎo)的最佳條件，探討黑水虻抗菌肽提取的最佳方法，為黑水虻抗菌肽的進(jìn)一步分離純化及活性研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

利用珠海市本地黑水虻資源建立種群，在珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心利用Tomberlin等篩選的紫花苜蓿人工飼料飼養(yǎng)。

1.2 供試用菌種及培養(yǎng)基

菌種:大腸桿菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，PH=7.4，以蒸餾水定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。

1.3 試劑

硫酸慶大霉素注射液 (80U/2mL)購(gòu)自廣州白云山天心制藥股份有限公司;滅菌注射用水購(gòu)自天津藥業(yè)焦作有限公司。

1.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

1.4.1 誘導(dǎo)齡期優(yōu)化

取2齡、3齡、4齡、5齡、6齡黑水虻幼蟲(chóng)各200頭，用大腸桿菌菌液 (3×1012個(gè)/mL)分別對(duì)其進(jìn)行針刺浸泡誘導(dǎo)，常規(guī)飼養(yǎng)24 h。提取各齡期幼蟲(chóng)抗菌肽，以大腸桿菌為指示菌測(cè)其抑菌活性。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

菌液注射誘導(dǎo):設(shè)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌2 個(gè)菌液注射組，每組設(shè)立 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 4個(gè)誘導(dǎo)劑量組;菌液針刺浸泡誘導(dǎo):設(shè)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌2個(gè)菌液針刺組，每組設(shè)立30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、90 s 6個(gè)浸泡誘導(dǎo)時(shí)間組;超聲波誘導(dǎo):設(shè)40 W、100 W 2個(gè)功率誘導(dǎo)組，每組設(shè)立5 min、10 min、15 min、20 min、30 min 5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間組。

每個(gè)處理均選取長(zhǎng)勢(shì)均一黑水虻5齡幼蟲(chóng)200頭，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的幼蟲(chóng)常規(guī)飼養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。以未誘導(dǎo)的黑水虻5齡幼蟲(chóng)為陰性對(duì)照，以慶大霉素為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 抗菌肽粗提物提取

取不同誘導(dǎo)處理的黑水虻幼蟲(chóng)分別稱重、沸水處死、剪碎。用組織研磨器在冰浴中搗碎、勻漿，將提取液與漿液以3∶1混合。將混合物4℃12000 r/min離心2次，每次30 min，取其上清冷凍干燥，配制2 μg/μL粗提物溶液待用。

1.6 抗菌肽粗提物活性測(cè)定

滴加20 μL培養(yǎng)24 h大腸桿菌菌液于LB平板，并將其均勻涂布，用滅菌打孔器以等邊三角形打3孔，孔徑均為6 mm。向孔中分別加入不同誘導(dǎo)幼蟲(chóng)抗菌肽溶液、未誘導(dǎo)幼蟲(chóng)抗菌肽溶液及慶大霉素溶液各30 μL，待溶液被培養(yǎng)基完全吸收后，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

利用 Excel2007、SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理;利用SPSS中One－Way ANOVA進(jìn)行方差分析及多重比較。以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘導(dǎo)齡期測(cè)定

經(jīng)方差分析及多重比較可知，黑水虻幼蟲(chóng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生抗菌肽活性隨齡期增加而增加，至5齡幼蟲(chóng)達(dá)到最佳抑菌活性，與其他齡期幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽活性相比差異顯著 (表1)，發(fā)育至6齡時(shí)抗菌肽抑菌活性開(kāi)始降低，但仍顯著高于2齡及3齡幼蟲(chóng)所產(chǎn)生抗菌肽活性。

表1 不同齡期黑水虻幼蟲(chóng)所產(chǎn)生抗菌肽對(duì)大腸桿菌活性Table 1 Antimicrobial peptides antibacterial activity against E.coli in different instars

2.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化及抑菌活性測(cè)定

2.2.1 菌液注射誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽粗提物抑菌活性

由圖1、圖2可知，注射10 μL大腸桿菌菌液飼養(yǎng)24 h后產(chǎn)生抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)，與其他注射組相比有顯著差異 (F:69.000，P＜0.01)，且隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及誘導(dǎo)劑量增加抑菌效果呈下降趨勢(shì);金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)劑量≤15 μL所產(chǎn)生抗菌肽對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌活性，但各劑量組間無(wú)顯著差異，但隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有活性降低趨勢(shì)。誘導(dǎo)劑量增至20 μL時(shí)，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽在各飼養(yǎng)時(shí)段對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑菌活性。

2.2.2 菌液針刺浸泡誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽粗提物抑菌活性

黑水虻5齡幼蟲(chóng)浸泡于不同菌液產(chǎn)生抗菌肽活性不同;不同浸泡時(shí)間，產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果亦存在差異。由圖3、圖4可知，大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最高，與浸泡30 s、40 s、50 s、90 s及金黃色葡萄球菌所有處理組產(chǎn)生抗菌肽活性相比差異顯著 (F:118.4，P＜0.01);且飼養(yǎng)至24 h所提取的抗菌肽抑菌活性最佳。

圖4 大腸桿菌針刺浸泡誘導(dǎo)60 s飼養(yǎng)24 h抗菌肽活性Fig.4 Antimicrobial peptides activity induced by E.coliliquid acupuncture for 60 s，24 h later

2.2.3 超聲波誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽活性

不同功率、不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同飼養(yǎng)時(shí)間黑水虻幼蟲(chóng)所產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果存在明顯差異(圖5、圖6)。100 W 超聲波誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)20 min，飼養(yǎng)24 h時(shí)產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最高與其他處理組及40 w超聲波誘導(dǎo)組相比差異顯著(F:480.033，P＜0.01)，但幼蟲(chóng)死亡率有所上升。

圖5 超聲波誘導(dǎo)幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽活性差異Fig.5 Differences of antimicrobial peptides activity induced by ultrasonic

2.2.4 最佳方法篩選

圖6 100 W超聲波誘導(dǎo)20 min飼養(yǎng)24 h幼蟲(chóng)抗菌肽活性Fig.6 Antimicrobial peptides activity induced by 100 W ultrasonic，24 h later

由表2可知，與其他處理組相比，大腸桿菌菌液針刺幼蟲(chóng)后浸泡60 s產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性與100 W超聲波誘導(dǎo)20 min所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最好，經(jīng)方差分析及多重比較二者間無(wú)顯著性差異。但100 W超聲波誘導(dǎo)處理黑水虻幼蟲(chóng)有死亡現(xiàn)象，因此，大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s方法為黑水虻抗菌肽誘導(dǎo)最佳方法。

表2 不同誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)黑水虻5齡幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽活性比較Table 2 Differences of 5thinstar black soldier fly larvae antimicrobial peptides activity induced by different methods

3 結(jié)論與討論

不同菌液誘導(dǎo)黑水虻后所產(chǎn)生抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌活性不同，相同菌液不同誘導(dǎo)方法，不同誘導(dǎo)濃度，不同誘導(dǎo)時(shí)間所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性亦不同，誘導(dǎo)后幼蟲(chóng)飼養(yǎng)時(shí)間不同所產(chǎn)生抗菌肽活性也不同。本文中大腸桿菌菌液針刺浸泡誘導(dǎo)60 s及100 W超聲波處理20 min，常規(guī)飼養(yǎng)24 h所產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性最強(qiáng)。相同誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)條件下，大腸桿菌菌液誘導(dǎo)黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果均優(yōu)于金黃色葡萄球菌菌液誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽抑菌效果。這可能是不同誘導(dǎo)源誘導(dǎo)昆蟲(chóng)所產(chǎn)生的免疫物質(zhì)存在活性差異 (XE Xiansheng et al.，2010)。黑水虻抗菌肽的這一特點(diǎn)與已知昆蟲(chóng)抗菌肽中富含脯氨酸和富含甘氨酸昆蟲(chóng)抗菌肽有相似之處 (高琳琳和李衛(wèi)東，2010)，具體屬于哪類抗菌肽還需進(jìn)一步研究。

不同誘導(dǎo)方法均可使黑水虻幼蟲(chóng)產(chǎn)生一定的抗菌肽，可見(jiàn)其免疫應(yīng)答為非專一性的，外界的各種病原體、異物、損傷等均可使其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而不存在某一特定的抗原物質(zhì)。

不同種類昆蟲(chóng)對(duì)不同誘導(dǎo)源有不同的免疫應(yīng)答。本文中黑水虻抗菌肽的最佳誘導(dǎo)方法是大腸桿菌菌液針刺浸泡60 s，最佳飼養(yǎng)時(shí)間為24 h;黃粉蟲(chóng)抗菌肽的最佳誘導(dǎo)方法是大腸桿菌菌液注射誘導(dǎo)，最佳飼養(yǎng)時(shí)間是48 h(陶淑霞等，2010);斜紋夜蛾抗菌肽的最佳誘導(dǎo)源是大腸桿菌菌液注射誘導(dǎo)，最佳飼養(yǎng)時(shí)間是20 h(陳莫林，2006);家蠶抗菌肽的最佳誘導(dǎo)方法是饑餓法 (范濤等，2009)。

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