張麗杰，董文軒

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

植物的生殖發(fā)育階段是其整個生命過程中非常重要的階段。由于植物的無融合生殖習(xí)性具有重要的生物學(xué)意義，并在縮短育種周期、固定雜種優(yōu)勢等方面具有重大潛力，因此，植物無融合生殖研究已是生物學(xué)研究的熱點之一。SERK(Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase)基因，全稱為“體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因”[1]，是體胚發(fā)生過程中最重要的基因，通常認(rèn)為，SERK基因與無融合生殖習(xí)性密切相關(guān)。SERK基因最初為Schmidt等人[2]在胡蘿卜Daucus carota的下胚軸中發(fā)現(xiàn)。隨后，有關(guān)研究者又在擬南芥Arabidopsis thaliana[3]、玉米Zea may[4]、苜蓿Medicago truncatula[5]等植物中克隆和鑒定了SERK基因。目前，科學(xué)家們已經(jīng)從向日葵Helian thusannuus[6]、 鴨 茅Dactylis glomerata[7]、 可 可Theobroma cacao[8]、 蜜 柑Citrus unshiu[9]、 草 地 早熟禾Poa pratensis[10]等植物中分離到不同的SERK基因。有關(guān)研究結(jié)果證明，SERK基因廣泛存在于雙子葉植物、單子葉植物及裸子植物中，組成了一個新的基因家族[11]。

無融合生殖現(xiàn)象在蘋果屬多倍體植物中普遍存在。無融合生殖后代是母本的復(fù)制品，不含有來自父本的遺傳物質(zhì)，保持了母本的全部特征。平 邑 甜 茶Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.varpingyiensisJiang是蘋果屬Malus湖北海棠Malus hupehensisRehd.的一個變種，是典型的無融合生殖型三倍體植物。平邑甜茶具有非常高的無融合生殖能力，其無融合生殖率在95%以上；但其雜交后代四倍性皺葉矮生株系的無融合生殖能力卻顯著降低。

為了探索SERK4基因在蘋果屬平邑甜茶及其雜交后代33#無融合生殖習(xí)性上的功能與作用，闡明該基因在植物胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)特性，以平邑甜茶及其雜種后代33#株系的cDNA為模板，擴(kuò)增出MhSERK4和MhdSERK4基因cDNA全長，再將其克隆到植物表達(dá)載體pBI121中，獲得了MhSERK4和MhdSERK4基因的植物表達(dá)載體pBI121-MhSERK4和pBI121-MhdSERK4，旨在將其轉(zhuǎn)化到番茄中，為進(jìn)一步研究SERK基因影響無融合生殖的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試的植物材料為蘋果屬三倍體無融合生殖型平邑甜茶Malus hupehensis(Pamp.) Rehd.var.pingyiensisJiang及其與扎矮山定子M.baccata雜交的后代四倍體皺葉矮生株系33#的花期子房。

1.2 菌株與質(zhì)粒

克隆載體PGM-T購自天根生物公司，植物表達(dá)載體pBI121和農(nóng)桿菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)張志宏教授饋贈。

1.3 試 劑

限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI、T4DNA連接酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑購自TAKARA生物公司，DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購于上海生物工程公司。

1.4 方 法

1.4.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)已獲得的平邑甜茶及其與扎矮山定子雜交獲得的雜種后代33#株系無融合生殖基因MhSERK4和MhdSERK4基因的CDS編碼區(qū)設(shè)計引物，在開放讀碼框兩端分別設(shè)計上游引物和下游引物，上游引物引入XbaI酶切位點，下游引物引入SmaI酶切位點。引物由賽百盛生物公司合成。

MhSERK4和MhdSERK4引物設(shè)計如下：

上游引物SF為 5’GGTCTAGAATGACGTCTT CCACCTCTGTTTC 3’；

下游引物SR為 5’ACCCCGGGTCATCTAGG ACCGGACAACTCAT 3’。

1.4.2 平邑甜茶及其雜交后代皺葉矮生33#株系RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

采用常規(guī)CTAB法提取平邑甜茶及其雜交后代皺葉矮生33#株系的子房RNA，在20 μL的反應(yīng)體系中加入RNA樣品，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈。其反應(yīng)程序為：65 ℃水浴5 min，立即置于冰上2～3 min，在PCR儀中37 ℃ 2.5 h，70 ℃ 15 min，使酶失活，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.3 目的基因的擴(kuò)增

目的基因的擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系。上下游 引 物 各 1 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq 0.25 μL，10×Buffer 2.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 補 足 至20 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min（94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min）；30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳純化，去除引物及引物二聚體，試劑盒回收目標(biāo)條帶。

1.4.4 pBI121-MhSERK4和pBI121-MhdSERK4的構(gòu)建

將平邑甜茶及其雜種后代33#株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的cDNA全長序列測序正確的PGM-MhSERK4和PGM-MhdSERK4克隆載體與CaMV35S組成型啟動子驅(qū)動的pBI121植物表達(dá)載體分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI進(jìn)行雙酶切，XbaI的識別位點為TCT AGA，SmaI的識別位點為CCC GGG。酶切體系為20 μL：XbaI和SmaI各 1 μL，BSA 2 μL，10×Buffer 2 μL，目的基因質(zhì)粒14 μL。用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段；使用AxyPrep膠回收試劑盒回收目的片段，并利用NEB公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶將MhSERK4和MhdSERK4基因定向插入pBI121表達(dá)載體中報告基因的位置，然后連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將以PCR法鑒定出的陽性克隆送北京華大生物有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

取3 μg所提平邑甜茶和雜交后代33#株系的RNA，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，RNA條帶清晰且完整。使用美國Beckman 公司生產(chǎn)的核酸蛋白分析儀檢測RNA 的含量和質(zhì)量，結(jié)果表明：OD260/OD280的比值分別為1.916 1和1.926 3，說明RNA的純度較高，無蛋白污染，可以用于后續(xù)的試驗。

圖1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果Fig.1 Result of RNA quality detection

2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增

以平邑甜茶和雜種后代33#子房cDNA為模板，采用設(shè)計的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，擴(kuò)增出約1 836 bp的片段，其大小與預(yù)期的結(jié)果一致，可以用于下一步的試驗。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Result of PCR ampli fi cation

2.3 pBI121-MhSERK4載體的鑒定

用回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并且用XbaI和SmaI酶切PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶XbaI和SmaI酶切載體pBI121，鑒定結(jié)果如圖3所示。然后連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆作PCR鑒定，鑒定結(jié)果見圖4。最后選取該陽性菌送往華大生物有限公司進(jìn)行測序分析，分析結(jié)果表明，其與PCR擴(kuò)增的cDNA序列的同源性達(dá)99.69%，說明是我們需要的目的基因。這一結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identi fi cation result of double enzyme digestion

圖4 PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identi fi cation result

3 討 論

成功構(gòu)建載體是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的前提。植物表達(dá)載體pBI121是從根癌農(nóng)桿菌雙元質(zhì)粒衍生而來的，屬組成型的表達(dá)載體，其大小為14 753 bp，帶有多個克隆位點，上游帶有CaMV35S啟動子，下游帶有GUS報告基因[12]；因此，pBI121是常用的植物表達(dá)載體[13]。在載體構(gòu)建過程中會受到多種因素的影響，不同的基因及不同的載體需要不同的反應(yīng)條件和體系。此外，基因序列的大小和載體的不同也是影響載體構(gòu)建的重要因素。為了分析從蘋果屬分離出來的MhSERK4基因的生物學(xué)功能，通過DNA測序和序列酶切位點分析，以XbaI和SmaI限制性內(nèi)切酶雙酶切帶有目的基因全長片段的克隆載體和pBI121植物表達(dá)載體，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析回收后，成功構(gòu)建了MhSERK4和MhdSERK4植物遺傳轉(zhuǎn)化載體，目前正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的研究。

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