梁楠松 ，周 姍 ，李蕾蕾 ，詹亞光 ，b，曾凡鎖 ，b，李 博

（東北林業(yè)大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.林木遺傳育種與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

多細(xì)胞生物的正常生長依賴于維持細(xì)胞增殖和分化的適當(dāng)平衡，破壞這個平衡會導(dǎo)致器官的生長和發(fā)育異常。bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物的生長發(fā)育過程中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)成了真核生物蛋白質(zhì)中的一個大家族，其成員在生物的生長發(fā)育過程中起著極為重要的調(diào)控作用[1]。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答和植物次生代謝中起到重要作用[2-7]。例如，bHLH可以參與植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成，轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體（MYB-bHLH-WD40）可以調(diào)控表皮毛和根毛的發(fā)育[8-9]；bHLH轉(zhuǎn)錄因子還參與了脅迫應(yīng)答作用，Kiribuchi等報道外源JA誘導(dǎo)水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子RERJ1基因在營養(yǎng)生長期的葉片、葉鞘和根中表達(dá)，并且RERJ1 基因在傷害和干旱脅迫下的葉片中上調(diào)表達(dá)[10]；bHLH轉(zhuǎn)錄因子對植物次生物質(zhì)代謝和花色素生物合成等方面也起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究表明，含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子R基因的產(chǎn)物L(fēng)c參與調(diào)控植物多個組織花青素的合成，對花青素合成的時間、分布和數(shù)量具有決定性作用[11]。

楊樹在全世界廣為栽植，也是我國主要用材樹種之一。小黑楊（Populus×xiaoheiT.S.Hwang et Liang）在我國大部分地區(qū)均有種植，具有生長快、適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，有著較強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿等生物學(xué)特性。其材質(zhì)細(xì)密，色白，心材不明顯，是良好的造紙用材，并在民用木材方面有著重要作用。小黑楊在黑龍江等干旱、寒冷地區(qū)長勢較好，是我國北方荒沙、干旱地區(qū)優(yōu)良的速生綠化樹種[12-13]。

本研究中獲得的2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子PxbHLH01和PxbHLH02與擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子bHLH UPBEAT1（UPB1）具有較高的同源性，而后者在擬南芥的活性氧代謝以及調(diào)節(jié)植物根部細(xì)胞增殖與分化過程中起到了重要作用，UPB1通過直接調(diào)控一組氧化物酶來調(diào)控細(xì)胞增殖和分化之間的平衡[14]。筆者認(rèn)為PxbHLH01和PxbHLH02也可能在這些方面具有重要的調(diào)控作用。為給小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02基因功能的研究提供參考，對小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)進(jìn)行了克隆，同時進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 取 樣

小 黑 楊（Populus×xiaoheiT.S.Hwang et Liang）取材于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗林場，取小黑楊新鮮葉片，液氮凍存后使用。

1.1.2 試劑與載體

Primer star Taq酶、凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體，購自于寶生物工程（大連）有限公司，擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)全長的克隆

以小黑楊新鮮葉片作為材料，應(yīng)用CTAB法提取總RNA。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照毛果楊基因組序列[15]，對PxbHLH01和PxbHLH02基因分別設(shè)計特異引物（見表1），以小黑楊葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸90 s；共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。應(yīng)用凝膠回收試劑盒對特異性擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 克隆PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)對應(yīng)引物Table 1 The primer used for cloning the coding regions in PxbHLH01 and PxbHLH02 genes

1.2.2 PxbHLH01和PxbHLH02啟動子的克隆

以小黑楊新鮮葉片作為材料，應(yīng)用CTAB法提取總DNA。參照毛果楊基因組序列[15]，對PxbHLH01和PxbHLH02基因上游啟動子區(qū)，按照擴(kuò)增片段為800～2000 bp大小，分別設(shè)計特異引物（見表2），以小黑楊葉片的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 45 s；55 ℃退火 45 s；72 ℃延伸 150 s；共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表2 克隆PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子對應(yīng)引物Table 2 The primer used for cloning the promoters in PxbHLH01 and PxbHLH02 genes

1.2.3 PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)和啟動子序列的生物信息學(xué)分析

利用在線分析工具GENSCAN[16]對小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02基因的核苷酸序列進(jìn)行分析。利用在線分析軟件Protparam[17]對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用在線分析軟件ProtScale[17]的Kyte and Doolittle算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析。利用在線分析工具SignalP[18]的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行信號肽的預(yù)測和分析。利用在線工具TMPred[19]進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析。利用在線分析工具COILS[20]進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測和分析。利用在線工具wolf psort[21]進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。采用GOR4[22-23]分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast對PxbHLH01和PxbHLH02基因序列以及推測的編碼蛋白進(jìn)行同源序列比對，搜索不同物種中的同源基因及蛋白。根據(jù)李軍等[24]推薦的軟件組合，先采用ClustalX將氨基酸序列進(jìn)行多序列比對的分析，然后利用MEGA 5.0軟件，算法為Neighbor-Joining，自檢舉1 000次，構(gòu)建進(jìn)化樹[25-26]。

利用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）分析PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子序列[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)全長和啟動子序列的鑒定

以小黑楊葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞后，通過與NCBI比對，確定獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因序列，分別為411 bp和417 bp。經(jīng)過比對，與擬南芥UPBEAT1、bHLH151基因核苷酸序列（AT2G47270.1）的一致性分別為38.85%和40.71%；與毛果楊未知功能基因核苷酸序列（XM_002320932.1）的一致性分別為97.57%和82.73%；與毛果楊未知功能基因核苷酸序列（XM_002301486.1）的一致性分別為82.38%和98.32%。

圖1 PxbHLH01(A)和PxbHLH02(B)基因PCR擴(kuò)增片段Fig.1 PCR ampli fi ed fragments of PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B)

以小黑楊葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，通過與NCBI比對，確定獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子序列，長度分別為1 360 bp和1 913 bp。經(jīng)過比對，與毛果楊未知功能基因（XM_002320932.1）啟動子的一致性分別為95.17%和68.91%；與毛果楊未知功能基因（XM_002301486.1）啟動子的一致性分別為69.46%和96.25%。

圖2 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）基因啟動子PCR擴(kuò)增片段Fig.2 PCR ampli fi ed fragments of PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) promoters

2.2 PxbHLH01和PxbHLH02蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析

2.2.1 氨基酸序列理化性質(zhì)分析

利用在線分析軟件Protparam對PxbHLH01和PxbHLH02基因的氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。PxbHLH01蛋白等電點(diǎn)（pI）為10.39；不穩(wěn)定系數(shù)為38.22（不穩(wěn)定系數(shù)小于40時，預(yù)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定，反之則不穩(wěn)定），為穩(wěn)定類蛋白；總平均疏水性為－0.767，說明該蛋白為親水性蛋白。PxbHLH02蛋白等電點(diǎn)為10.59；不穩(wěn)定系數(shù)為53.02，為不穩(wěn)定類蛋白；總平均疏水性為－0.666，為親水性蛋白。

2.2.2 疏水區(qū)域/親水區(qū)域預(yù)測

蛋白質(zhì)親疏水性氨基酸的組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力，通過親水性預(yù)測可以反映蛋白質(zhì)的折疊情況。利用在線分析軟件ProtScale的Kyte and Doolittle算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析（＞0.5區(qū)域為疏水區(qū)，＜－0.5區(qū)域為親水區(qū)，介于＋0.5～－0.5 之間主要為兩性區(qū)域）。結(jié)果表明，PxbHLH01蛋白共有8個疏水區(qū)和10個親水區(qū)（見圖3A）；PxbHLH02蛋白共有4個疏水區(qū)和9個親水區(qū)（見圖3B）。

2.2.3 信號肽的預(yù)測和分析

信號肽是N端的一段氨基酸序列，指導(dǎo)分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成，在蛋白質(zhì)合成結(jié)束之前被切除，信號肽位于蛋白質(zhì)的N端，一般由16～26個氨基酸殘基組成，其中包括疏水核心區(qū)、信號肽的C端和N端[28]。利用在線分析工具SignalP的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，PxbHLH01（見圖4A）和PxbHLH02（見圖4B）蛋白可能均不存在信號肽。

圖3 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白親水/疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity / phydrophilicity prediction of PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins

圖4 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白信號肽的預(yù)測和分析（神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法）Fig.4 Prediction and analysis of signal peptides in PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins using the neural network algorithm

2.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析

跨膜結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)與膜內(nèi)在蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合相互作用與膜結(jié)合的一段氨基酸片段，一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋[29]。利用在線工具TMPred對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，PxbHLH01（見圖5A）和PxbHLH02（見圖5B）蛋白可能不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

圖5 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析Fig.5 Prediction and analysis of transmembrane domain prediction in PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins

2.2.5 亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用在線工具WoLF PSORT分別對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。PxbHLH01蛋白在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)得分為8.0；PxbHLH02蛋白在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中得分為7.0。

2.3 PxbHLH01和PxbHLH02蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析

應(yīng)用GOR4對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。PxbHLH01和PxbHLH02蛋白均是由α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）、無規(guī)則卷曲（Random coil）所組成的，并且分布于整個蛋白。PxbHLH01蛋白由39.71%的α-螺旋、57.47%的無規(guī)則卷曲和8.82%延伸鏈組成（見圖6A）；PxbHLH02蛋白由54.35%的α-螺旋、42.03%的無規(guī)則卷曲和3.62%延伸鏈組成（見圖6B）。

圖6 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Secondary structure prediction of PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins

2.4 PxbHLH01和PxbHLH02蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用在線分析工具Swiss-Model，對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模，用Swiss-PdbViewer軟件對建模結(jié)果進(jìn)行處理[30-32]。PxbHLH01蛋白同源建模結(jié)果如圖7 A所示，PxbHLH02蛋白同源建模結(jié)果如圖7 B所示。同時，利用軟件的α-碳與酰胺平面交角圖功能，可以找到1個殘基與1個特定平面的構(gòu)象角（二面角），通過分析二面角，可以判斷一個模型的質(zhì)量。對PxbHLH01（見圖8 A）和PxbHLH02（見圖8 B）蛋白的二面角分析結(jié)果表明，蛋白質(zhì)殘基位于核心區(qū)域，說明空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以同源建模的方法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的氨基酸序列的建模結(jié)果可靠。

圖7 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Three-dimensional structure prediction of PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins

2.5 PxbHLH01和PxbHLH02蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast對PxbHLH01和PxbHLH02基因序列以及推測的編碼蛋白進(jìn)行同源序列比對，Blastp比對結(jié)果表明，PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊Populus trichocarpa（XP_002320968.1和 XP_002301522.1）、 擬南 芥Arabidopsis thaliana（NP_566098.1）、大 豆Glycine max（XP_003556194.1）、 玉 米Zea mays（DAA58466.1）、 水 稻Oryza sativaIndica Group（EAY87819.1）、 葡 萄Vitis vinifera（XP_003632412.1）、 甘 藍(lán)Brassica oleraceavar.capitata（ADK56282.1）、 苜 蓿Medicago truncatula（XP_003617449.1）、 云 杉Picea sitchensis（ADE76325.1）、高粱Sorghum bicolor（XP_002462412.1） 和 蓖 麻Ricinus communis（XP_002515253.1）同源性較高，一致性分別為97%和76%、77%和97%、50%和45%、53%和54%、41%和41%、42%和35%、50%和57%、50%和24%、49%和48%、42%和44%、43%和43%、50%和57%。

圖8 PxbHLH01（A）和PxbHLH02（B）蛋白質(zhì)殘基二面角預(yù)測Fig.8 Prediction of residue dihedral angles in PxbHLH01 (A) and PxbHLH02 (B) proteins

系統(tǒng)進(jìn)化樹是物種的進(jìn)化史，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以根據(jù)這些物種的祖先描述它們的進(jìn)化關(guān)系[33]。先采用ClustalX對NCBI比對的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對的分析，然后利用MEGA 5.0軟件，應(yīng)用Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖9）。結(jié)果表明，12個物種的14條蛋白序列大致分為4個大類：其中小黑楊、毛果楊、蓖麻、葡萄、大豆、擬南芥和甘藍(lán)聚成一類，云杉、苜蓿和玉米聚成一類，水稻和高粱分別單獨(dú)聚成一類。PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊P.trichocarpa（XP_002301522.1和XP_002320968.1）有著較近的親緣關(guān)系。小黑楊、毛果楊等與擬南芥A.thaliana（NP_566098.1）的遺傳距離也較近，說明它們在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近；與水稻和高粱遺傳距離較遠(yuǎn)，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖9 根據(jù)PxbHLH01和PxbHLH02蛋白NCBI Blastp比對結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of PxbHLH01 and PxbHLH02 proteins based on the Blastp results from NCBI

2.6 PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子中含有的順式作用元件的鑒定及分析

利 用 PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子序列。PxbHLH01和PxbHLH02基因可能含有的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如表3所示。結(jié)果表明在PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子中有轉(zhuǎn)錄必備的RNA聚合酶結(jié)合TATA box、CAAT box以及一些壓力響應(yīng)元件（如脫水響應(yīng)元件）和激素響應(yīng)元件（如生長素、脫落酸、赤霉素、水楊酸等的調(diào)控元件），此外，還有一些光調(diào)控元件等。

3 結(jié)論與討論

在擬南芥中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子UPBEAT1（UPB1）通過直接調(diào)控一組氧化物酶來調(diào)控根部細(xì)胞增殖和分化之間的平衡。根據(jù)毛果楊序列設(shè)計引物克隆所獲得的PxbHLH01和PxbHLH02基因，經(jīng)多序列比對，結(jié)果表明與擬南芥編碼bHLH結(jié)構(gòu)域的功能蛋白UPBEAT1（UPB1）有較高同源性。

為了鑒定PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的功能，通過在線工具對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進(jìn)行了預(yù)測和生物信息學(xué)分析。經(jīng)預(yù)測分析，結(jié)果表明PxbHLH01和PxbHLH02蛋白均為親水性蛋白質(zhì)。這2個蛋白可能不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。這正與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果相互印證，2個蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測是在細(xì)胞質(zhì)。這說明，PxbHLH01和PxbHLH02蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中起作用，而非分泌蛋白。對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的二級結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測結(jié)果表明，2個蛋白都是由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲所組成的。通過對蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的同源建模，繪制出2個蛋白可能的結(jié)構(gòu)模型（見圖7、8），表明了這2個基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)為bHLH（basic helix-1oop-helix）結(jié)構(gòu)。將PxbHLH01和PxbHLH02的氨基酸序列應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的Blastp進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明，PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊、擬南芥、大豆、玉米、水稻、葡萄、甘藍(lán)、苜蓿、云杉、高粱和蓖麻等物種的對應(yīng)蛋白的同源性較高。同時應(yīng)用比對結(jié)果構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖9）。進(jìn)化樹表明，小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊、蓖麻、葡萄、大豆、擬南芥和甘藍(lán)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子UPBEAT1聚成一類，說明它們在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。

表3 PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子順式調(diào)控元件分析Table 3 Analysis of promoter cis-regulatory elements in PxbHLH01 and PxbHLH02

續(xù)表3Table 3 Continuation

本研究中同時對PxbHLH01和PxbHLH02基因上游啟動子進(jìn)行了克隆與分析，通過順式作用元件分析表明，所獲得的啟動子序列具有啟動轉(zhuǎn)錄的必要元件。同時，存在一些逆境調(diào)控、激素調(diào)控、光調(diào)控和代謝相關(guān)的一些元件。啟動子中有大量的抗脅迫功能元件，而這些逆境調(diào)控元件中，脫水響應(yīng)基因占有較大比例，表明PxbHLH01和PxbHLH02基因有可能參與了植物對脅迫的響應(yīng)過程，并且，在植物的抗旱過程中起到重要作用，參與植物的脫水響應(yīng)調(diào)控。大量的激素調(diào)控元件表明，PxbHLH01和PxbHLH02基因可能與植物激素調(diào)控有關(guān)。值得注意的是，在分析啟動子元件時發(fā)現(xiàn)了多個氧應(yīng)答元件（CURECORECR），表明PxbHLH01和PxbHLH02基因的功能可能與之前的研究相一致，通過調(diào)控植物體內(nèi)的氧化物酶來調(diào)控植物生長。

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