劉慧敏，烏云塔娜，杜紅巖

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；3.國家林業(yè)局 杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲又名絲連皮、扯絲皮、絲棉皮、玉絲皮、思仲等，屬落葉喬木。杜仲是我國特有樹種，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，被確定為國家二級珍貴保護(hù)樹種，也是世界上適應(yīng)范圍最廣的重要膠原植物，中國是現(xiàn)存杜仲的唯一原產(chǎn)地[1-4]。千百年來，杜仲以去皮入藥而著稱，為中藥上品。近20年來，隨著杜仲膠特殊性能的不斷發(fā)現(xiàn)，杜仲資源在全國各地區(qū)迅速發(fā)展[5]。杜仲膠是普通天然橡膠（三葉橡膠）的同分異構(gòu)體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為反式-聚異戊二烯(C5H8)n，是一種特殊的天然高分子材料[6]。杜仲膠具有低溫可塑、形狀記憶、投雷達(dá)波、耐磨、耐腐蝕、減震、隔音等特性，并將與相關(guān)材料的共混、集成、改性等多功能集于一身，其產(chǎn)業(yè)前景十分廣闊[2,7-9]。

2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑是植物萜類生物合成上游重要的調(diào)控路徑之一。萜類在植物的多種生命活動如光合與呼吸代謝、激素調(diào)節(jié)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物通訊及與環(huán)境互作等過程中都發(fā)揮著重要作用[10-13]。

內(nèi)含子（intron）為真核細(xì)胞基因DNA中的間插序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨即被剪輯除去而不翻譯。大約80%～85%的高等植物含有內(nèi)含子，不同基因的內(nèi)含子數(shù)目各異。長期以來，人們普遍認(rèn)為內(nèi)含子沒有功能作用，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子在基因表達(dá)調(diào)控中有很重要的作用，內(nèi)含子會影響基因表達(dá)模式，可以增強(qiáng)基因表達(dá)水平，還能驅(qū)動基因表達(dá)[14]。隨著對內(nèi)含子功能認(rèn)識的逐步深入，內(nèi)含子將會成為精確地調(diào)控目的基因表達(dá)的有力工具，在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用[15]。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料

本研究采用的數(shù)據(jù)全部來自杜仲膠合成時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和杜仲基因組測序數(shù)據(jù)。

1.2 分析方法

用在線軟件GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php），分析MEP途徑系列基因的內(nèi)含子和外顯子[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲M(fèi)EP途徑EuDXS基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因（EuDXS2）的全長cDNA和EuDXS2的基因組數(shù)據(jù)提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuDXS2基因結(jié)構(gòu)示意圖，如圖1所示。分析發(fā)現(xiàn)，EuDXS2基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 853 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，包含9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，2處為“1”，無“2”相位（見圖1，表1）。

圖1 EuDXS2基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.1 Distribution of the introns and exons in EuDXS2

表1 EuDXS2基因內(nèi)含子和外顯子的分布Table 1 Distribution of the introns and exons in EuDXS2

2.2 杜仲M(fèi)EP途徑EuDXR基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因（EuDXR）的全長cDNA和EuDXR的基因組數(shù)據(jù)提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuDXR基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖2）。分析發(fā)現(xiàn)，EuDXR基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 120 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 163 bp，包含11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，1處為“1”，2處為“2” (見圖2，表2)。

圖2 EuDXR基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.2 Distribution of the introns and exons in EuDXR

表2 EuDXR基因內(nèi)含子和外顯子的分布Table 2 Distribution of the introns and exons in EuDXR

2.3 4-杜仲M(fèi)EP途徑EuCMK基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測

將杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶基因（EuCMK）基因的全長cDNA和基因組序列中EuCMK的序列提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuCMK基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖3）。分析發(fā)現(xiàn)，EuCMK基因5′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為424 bp，包含10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，2處為“1”，1處為“2”（見圖3，表3）。

圖3 EuCMK基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.3 Distribution of the introns and exons in EuCMK

2.4 杜仲M(fèi)EP途徑EuMDS基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測及分析

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合酶基因（EuMDS）的全長cDNA和EuMDS的基因組數(shù)據(jù)提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuMDS基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖4）。分析發(fā)現(xiàn)，EuMDS基因5′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有1處為“0”，1處為“1”（見圖4，表4）。

表3 EuCMK基因內(nèi)含子和外顯子的分布Table 3 Distribution of the introns and exons in EuCMK

圖4 EuMDS基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.4 Distribution of the introns and exons in EuMDS

表4 EuMDS基因內(nèi)含子和外顯子的分布Table 4 Distribution of the introns and exons in EuMDS

2.5 杜仲M(fèi)EP途徑EuHDS基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測及分析

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶基因（EuHDS）的全長cDNA和EuHDS的基因組數(shù)據(jù)提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuHDS基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖5）。分析發(fā)現(xiàn)，EuHDS基因5′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，包含18個(gè)內(nèi)含子和19個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有12處為“0”，3處為“1”，3處為“2”（見圖5，表5）。

圖5 EuHDS基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.5 Distribution of the introns and exons in EuHDS

2.6 杜仲M(fèi)EP途徑EuHDR基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測及分析

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶基因（EuHDR）的全長cDNA和EuHDR的基因組數(shù)據(jù)提交到在線軟件GSDS中，繪制出EuHDR基因結(jié)構(gòu)示意圖（見圖6）。分析發(fā)現(xiàn)，EuHDR基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 347 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為3 000 bp，包含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有5處為“0”，3處為“2”（見圖6，表6）。

圖6 EuHDR基因內(nèi)含子和外顯子的分布Fig.6 Distribution of the introns and exons in EuHDR

表5 EuHDS基因內(nèi)含子和外顯子的分布Table 5 Distribution of the introns and exons in EuHDS

表6 EuHDR基因內(nèi)含子和外顯子分布表Table 6 Distribution of the introns and exons in EuHDR

3 結(jié)論與討論

以杜仲轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，預(yù)測了杜仲M(fèi)EP途徑6條酶基因的基因結(jié)構(gòu)。EuDXS是MEP途徑的第1個(gè)限速酶，EuDXS2基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 853 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，包含9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，2處為“1”，無“2”相位；EuDXR是MEP途徑的第2個(gè)關(guān)鍵酶，EuDXR基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 120 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 163 bp，包含11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，1處 為“1”，2處 為“2”；EuCMK催化MEP途徑的羧基磷酸化反應(yīng)，EuCMK基因5′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為424 bp，包含10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有7處為“0”，2處為“1”，1處為“2”；EuMDS催化MEP途徑的第5步酶促反應(yīng)，EuMDS基因5′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為5 000 bp，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有1處為“0”，1處為“1”；EuHDS為MEP途徑的第6個(gè)作用酶，EuHDS基因5′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為2 000 bp，包含18個(gè)內(nèi)含子和19個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有12處為“0”，3處為“1”，3處為“2”；EuHDR是MEP途徑的第3個(gè)關(guān)鍵酶，EuHDR基因5′端非編碼區(qū)的長度為1 347 bp，3′端非編碼區(qū)的長度為3 000 bp，包含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，內(nèi)含子的相位有5處為“0”，3處為“2”。此次結(jié)果為預(yù)測數(shù)據(jù)，基因的具體結(jié)構(gòu)還需要在理論的指導(dǎo)下通過試驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，國內(nèi)有關(guān)植物MEP途徑酶基因的內(nèi)含子生物信息學(xué)分析尚處于空白階段，大都停留在轉(zhuǎn)錄組水平。2012年劉攀峰[17]分離鑒定了杜仲M(fèi)EP途徑系列基因的全長cDNA，并對其序列特征進(jìn)行了研究， 在杜仲中發(fā)現(xiàn)2個(gè)DXS酶基因家族成員，EuDXS1和EuDXS2，2個(gè)DXR酶基因家族成員，EuDXR1和EuDXR2，分離出1個(gè)MCT酶基因，1個(gè)CMK酶基因，1個(gè)MDS酶基因，1個(gè)HDS酶基因，1個(gè)HDR酶基因和1個(gè)IPI基因。

2012年張祖榮[18]等人克隆獲得了黃花蒿MEP途徑的關(guān)鍵酶HDS，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能互補(bǔ)分析研究，得到1條長2 324 bp的HDScDNA序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，黃花蒿HDS基因與其它種子植物來源的HDS高度同源。

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