烏云塔娜，劉慧敏，杜紅巖

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學(xué)院，湖南 長沙 410004)

杜仲Eucommia ulmoidesOlive是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種，屬國家二級保護(hù)植物，其樹葉、樹皮、果實均含豐富的杜仲膠，杜仲皮為中藥上品，也是我國傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯商品之一[1-4]。杜仲膠在國際上被稱為古塔波膠，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為反式-聚異戊二烯(C5H8)n，是普通天然橡膠巴西橡膠的同分異構(gòu)體[5]。杜仲膠高彈性體具有“橡膠-塑料”雙重特性和形狀記憶等特殊功能[6]，能廣泛應(yīng)用于交通、通訊、醫(yī)療、電力、國防、水利、建筑和人們的日常生活中，其產(chǎn)業(yè)化前景十分廣闊[7-9]。

植物中用于不同萜類化合物合成的前體物異戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP）和二甲烯丙基二磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）在質(zhì)體中主要是由2-C-甲基-D-赤蘚糖醇 -4-磷 酸（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate,MEP）途徑合成的[10-12]。該途徑的終產(chǎn)物IPP是許多萜類物質(zhì)（包括杜仲膠）的前體物，該途徑涉及到多種酶的參與，許多基因受到多基因編碼和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)?；蛑械?′段非編碼區(qū)存在著與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的序列，包括啟動子、增強(qiáng)子、應(yīng)答軟件等順式作用元件及一些常見的組件TATA盒、CAAT盒等調(diào)節(jié)組件，是調(diào)控翻譯的一個重要組成部分。目前無論是在人、動物還是在植物、真菌中均有關(guān)于5′端非編碼區(qū)的研究。2012年高震[13]對小麥屬和山羊草屬Waxy基因5′端非編碼區(qū)序列的變異進(jìn)行了分析，采用了PCR克隆、聚類分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析等方法深入了解了小麥屬和山羊草屬Waxy基因5′端的變異，為進(jìn)一步了解Waxy基因的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，以及利用小麥屬和山羊草屬基因資源奠定基礎(chǔ)。2013年Wenjing Wu[14]等人通過將一段2.0 kb的5′非編碼區(qū)的片段克隆到熒光素酶報告基因載體上，缺失和突變分析表明Ets-2結(jié)合位點是尿路上皮癌抗原1（UCA1）基因啟動子或活性的關(guān)鍵。Keunsub Lee[15]等對利用轉(zhuǎn)錄組序列土壤農(nóng)桿菌A.tumefaciens C58進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點定位分析發(fā)現(xiàn)其5′端非編碼區(qū)的長度超過60 nt，表明有大量的順式作用元件被編碼在土壤農(nóng)桿菌的基因組中。

1 材料與方法

1.1 序列來源

本研究所用數(shù)據(jù)資料來自杜仲膠合成時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和杜仲全基因組測序數(shù)據(jù)。

1.2 分析方法

利 用 PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件預(yù)測MEP途徑系列基因5′端非編碼區(qū)中的順式作用元件，用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）在線軟件做輔助分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲MEP途徑EuDXS基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因（EuDXS2）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuDXS2基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuDXS2基因5′端非編碼區(qū)共有22種共220個順式作用元件，不僅包括啟動子順式元件TATA-box、CAAT-box等，還包括光應(yīng)答、熱脅迫、干旱誘導(dǎo)、類黃酮生物合成、胚乳表達(dá)、糖抑制、真菌誘導(dǎo)、乙烯應(yīng)答等多種元件；EuDXS2基因5′端非編碼區(qū)包含TATA-box可能的位點有145個，占總元件的65.91%；CAAT-box可能的位點有39個，占總元件的17.73%（見表1）。

2.2 杜仲MEP途徑EuDXR基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶基因（EuDXR）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuDXR基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuDXR基因5′端非編碼區(qū)共有21種共127個順式作用元件，包括CAAT-box、TATA-box等元件，還涉及到光應(yīng)答、厭氧感應(yīng)、乙烯響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、熱脅迫、干旱誘導(dǎo)、胚乳表達(dá)、水楊酸響應(yīng)等多種方面。順式元件中包含27個CAAT-box，占總元件的21.26%；68個TATA-box，占總元件的53.54%（見表2）。

2.3 杜仲MEP途徑EuCMK 基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

將4-（5′-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶基因（EuCMK）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuCMK基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuCMK基因5′端非編碼區(qū)共有24種共134個順式作用元件，包括CAAT-box和TATA-box等順勢元件，此外還涉及到光應(yīng)答、胚乳表達(dá)、熱脅迫、防御和應(yīng)激、乙烯響應(yīng)、干旱誘導(dǎo)、莖特異表達(dá)、晝夜調(diào)節(jié)等多種方面。預(yù)測出32個CAAT-box，占總元件的23.88%；68個TATA-box，占總元件的50.75%（見表3）。

表1 EuDXS2基因5′端順式作用元件分布Table 1 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuDXS2 5′end

表2 EuDXS2基因5′端順式作用元件分布Table 2 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuDXR 5′end

表3 EuCMK基因5′端順式作用元件分布Table 3 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuCMK 5′end

2.4 杜仲MEP途徑EuMDS基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件分析

將2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合酶基因（EuMDS）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuMDS基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuMDS基因5′端非編碼區(qū)共有30種共104個順式作用元件，包括CAAT-box和TATA-box等順式元件，此外還涉及到光應(yīng)答、脫落酸響應(yīng)、厭氧感應(yīng)、真菌誘導(dǎo)、分生組織、胚乳表達(dá)、熱脅迫、低溫響應(yīng)、糖抑制、晝夜調(diào)節(jié)等多種方面。預(yù)測出43個CAAT-box，占總元件的41.35%；23個TATA-box，占總元件的23.08%（見表4）。

2.5 杜仲MEP途徑EuHDS基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件分析

將1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶基因（EuHDS）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuHDS基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuHDS基因5′端非編碼區(qū)共有35種共126個順式作用元件，包括TATA-box和CAAT-box等順式元件，此外還涉及到光應(yīng)答、脫落酸響應(yīng)、木質(zhì)部表達(dá)、厭氧感應(yīng)、真菌誘導(dǎo)、茉莉酸響應(yīng)、缺氧反應(yīng)、熱脅迫、胚乳表達(dá)、分生組織活性、防御和應(yīng)激、晝夜調(diào)節(jié)等多種方面。預(yù)測出29個CAAT-box，占總元件的23.02%；34個TATA-box，占總元件的26.98%（見表5）。

2.6 杜仲MEP途徑EuHDR基因5′端非編碼區(qū)順式作用元件分析

將1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶基因（EuHDR）的5′端非編碼區(qū)序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預(yù)測EuHDR基因5′端可能存在的順式作用元件。結(jié)果表明：EuHDR基因5′端非編碼區(qū)共有24種共115個順式作用元件，包括TATA-box和CAAT-box等順式元件，此外還涉及到光應(yīng)答、真菌誘導(dǎo)、分生組織活性、茉莉酸響應(yīng)、胚乳表達(dá)、熱脅迫、干旱誘導(dǎo)、防御和應(yīng)激反應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、生長素響應(yīng)等多種方面。預(yù)測出19個CAAT-box，占總元件的16.52%；67個TATA-box，占總元件的58.26%（見表6）。

表4 EuMDS基因5′端順式作用元件分布Table 4 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuMDS 5′end

3 結(jié)論與討論

以杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，預(yù)測了杜仲MEP途徑6條酶基因5′端非編碼區(qū)中可能存在的順式作用元件，為從分子水平上進(jìn)一步研究MEP生物合成途徑的調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。EuDXS是MEP途徑的第1個關(guān)鍵酶，EuDXS2基因5′端非編碼區(qū)共有22種共220個順式作用元件，其中有145個TATA-box，占總元件的65.91%，39個CAAT-box，占總元件的17.73%；EuDXR是MEP途徑的第2個限速酶，EuDXR基因5′端非編碼區(qū)共有21種共127個順式作用元件，其中有27個CAAT-box，占總元件的21.26%；68個TATA-box，占總元件的53.54%；EuCMK催化MEP途徑的羧基磷酸化反應(yīng)，EuCMK基因5′端非編碼區(qū)共有24種共134個順式作用元件，其中有32個CAAT-box，占總元件的23.88%；68個TATA-box，占總元件的50.75%；EuMDS催化MEP途徑的第5步酶促反應(yīng)，EuMDS基因5′端非編碼

區(qū)共有30種共104個順式作用元件，其中有43個CAAT-box，占總元件的41.35%；23個TATA-box，占總元件的23.08%；EuHDS為MEP途徑的第6個作用酶，EuHDS基因5′端非編碼區(qū)共有35種共126個順式作用元件，其中有29個CAAT-box，占總元件的23.02%；34個TATA-box，占總元件的26.98%；EuHDR是MEP途徑的第3個限速酶，EuHDR基因5′端非編碼區(qū)共有24種共115個順式作用元件，其中有19個CAAT-box，占總元件的16.52%；67個TATA-box，占總元件的58.26%。此結(jié)果為用生物信息學(xué)軟件參考其它植物的序列預(yù)測的數(shù)據(jù)，5′端非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)及功能，尤其是啟動子部分CAAT-box和TATA-box的具體位置及功能還需要在此理論的指導(dǎo)下通過試驗驗證。

表5 EuHDS基因5′端順式作用元件分布Table 5 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuHDS 5′end

表6 EuHDR基因5′端順式作用元件分布Table 6 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuHDR 5′end

目前，MEP途徑酶基因5′端的生物信息學(xué)研究鮮見報道，大部分研究停留在轉(zhuǎn)錄組水平。2009年李輝亮[16]等人克隆了巴西橡膠樹4-羥基-3-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸還原酶基因（HbHDR）并對其表達(dá)做了分析，得到的HbHDR長1 627 bp，編碼462個氨基酸，屬于LYTB家族，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，乙烯誘導(dǎo)膠乳HbHDR的表達(dá)。2007年馬靚[17]克隆了煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）基因全長cDNA并對其序列做了分析，克隆得到的基因全長為1 804 bp，共編碼473個氨基酸，同源序列比對發(fā)現(xiàn)DXR氨基酸序列和本賽姆式煙草DXR的一致性達(dá)到97%，進(jìn)化樹分析顯示煙草DXR與番茄DXR的親緣關(guān)系最近，且基本反應(yīng)了10種不同植物DXR之間的進(jìn)化關(guān)系。

文中對MEP途徑系列基因5′端非編碼區(qū)的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測，為進(jìn)一步研究MEP生物合成途徑中相關(guān)基因的啟動子克隆、啟動子結(jié)構(gòu)和功能以及MEP途徑產(chǎn)物的分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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