烏云塔娜，王 淋，葉生晶

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003；3.中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；b.林學(xué)院， 湖南 長沙410004；4.國家林業(yè)局中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，湖南 長沙 410014）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.為杜仲科杜仲屬植物，是僅存的孑遺植物[1]。杜仲為落葉喬木，是我國特有的經(jīng)濟(jì)樹種[2]。杜仲在我國的栽培面積約占世界的90%以上，我國的中亞熱帶到暖溫帶地區(qū)均有分布，多達(dá)16個省、市[3]。 由于杜仲具有藥用價值，含有大量的京尼平苷酸、綠原酸等，具有鎮(zhèn)痛、保肝等功效[4]，而且杜仲的樹皮、果實以及葉子中均有含有杜仲膠，可代替天然橡膠，具有很高的商業(yè)價值[5-6]。因此杜仲被稱為世界上適應(yīng)范圍最廣的重要膠源樹種[7-8]，杜仲膠被譽(yù)為基因橡塑二重性的高分子合金材料[9]。

杜仲天然橡膠（杜仲膠）又名古塔波膠（Gutta percha），其化學(xué)結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯，而普通天然橡膠巴西橡膠為順式聚異戊二烯，兩者互為同分異構(gòu)體[10]。杜仲膠是一種多萜類化合物，萜類物質(zhì)（Terpenoids）是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，1958年，Lynen等[11-12]提出了萜類物質(zhì)合成是主要由位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸（Mevalonate,MVA）途徑完成。隨后日本學(xué)者用同位素標(biāo)定法標(biāo)記萜類物質(zhì)合成MVA 途徑代謝的中間產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)MVA代謝途徑存在于杜仲的含膠細(xì)胞中[13]。因此，目前推測杜仲膠有可能在細(xì)胞質(zhì)途徑中發(fā)生。

乙酰COA?；D(zhuǎn)移酶（acetoacetylCoA thiolase，ACOT）是萜類物質(zhì)合成MVA途徑起始酶[10]，對眾多蛋白的?；叭ヵ；鸫呋饔肹14-15]。在MVA途徑中，2個乙酰CoA分子（acetylCoA）在乙酰乙酰CoA硫解酶（ACOT）作用下，合成乙酰乙酰CoA （acetoacetylCoA），是合成萜類物質(zhì)必須前體異戊烯焦磷酸（IsopentenylPP, IPP）的第一步[16-17]。

文中通過杜仲轉(zhuǎn)錄組以及基因組序列得到了杜仲ACOTS基因家族序列，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，從植物功能基因轉(zhuǎn)錄水平的角度探討了EuACOTS基因家組的調(diào)控機(jī)制，旨在為生物合成杜仲膠方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

對杜仲膠合成時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋和杜仲全基因組測序數(shù)據(jù)為依據(jù)進(jìn)行序列相關(guān)生物信息學(xué)分析[18-19]。

1.2 方 法

利用 ExPASyProtParam（http: / /cn.expasy.org）程序與ScanProsite程序?qū)uACOTS家族基因氨基酸殘基數(shù)、氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對分子量、理論等電點、蛋白質(zhì)的親疏水性等性質(zhì)以及蛋白的結(jié)果保守域進(jìn)行了預(yù)測與分析；利用TMHMM程序 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用PSIPRED程序（http: / /bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用Swiss model （http://swissmodel.expasy.org/）程序，根據(jù)基因氨基酸序列進(jìn)行建模，預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；利用在線軟件MEME（http://meme.nbcr.net/meme/）預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)保守域；利用軟件GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）對基因的內(nèi)含子和外顯子進(jìn)行了分析；利用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）和 PLANT CARE （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件預(yù)測EuACOTS家族啟動子序列中可能存在的順式元件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACOTS基因家族序列分析

杜 仲EuACOTS（EuACOT8、EuACOT9、EuACOT10）基因家族氨基酸序列與擬南芥Arabidopsis thaliana、 葡 萄Viteus vitifoliae的ACOT基因家族的基因序列相似性達(dá)到80%以上（見圖1），因此命名為EuACOTS，EuACOTS基因在杜仲中至少包含3個家族成員EuACOT8、EuACOT9、EuACOT10[20]。通過Prosite數(shù)據(jù)庫（http://prosite.expasy.org/）分析EuACOTS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)位點，結(jié)果表明，EuACOT8的第354～370氨基酸殘基、EuACOT9的350～366氨基酸殘基、EuACOT10的354～370氨基酸殘基均存在保守序列 NvhGGaVSlGHPlGcSG；EuACOT8的 第 389～402氨基酸殘基、EuACOT9的385～398氨基酸殘基、EuACOT10的389～402氨基酸殘基存在保守序列GVGGICNGgGgAsA，2個保守序列均為硫解酶特異序列（見圖1），EuACOTS屬于硫解酶。

2.2 ACOTS基因家族聚類分析

利用MEGA軟件的鄰結(jié)法（neighbor joining, NJ），構(gòu)建了杜仲ACOTS的系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖2）。選擇單子葉植物玉米Zea mays、雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Viteus vitifoliae、苔蘚類小立碗蘚Physcomitrella patens的ACOT基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析。從進(jìn)化樹中可見，共分為3個主要的分支，其中EuACOTS位于1個分支，且于雙子葉植物擬南芥和葡萄的遺傳距離較近，與單子葉植物玉米以及蘚類遺傳距離較遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)的分類結(jié)果相一致。

圖1 全長ACOTS蛋白多序列對比Fig.1 Multiple sequence alignment of the full length ACOTS proteins

圖2 ACOTS蛋白的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of ACOTS proteins

2.3 ACOTS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用生物信息學(xué)在線軟件，對ACOTS基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，如表1所示。EuACOTS編碼氨基酸分別為406 aa、314 aa、406 aa；理論等電點分別為 5.66、8.92、5.80；EuACOTS均屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白，與其親緣關(guān)系較為相近的VvACOT2a、VvACOT2b以及AtACOT2a屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白相一致。

表1 EuACOTS編碼氨基酸的基本理化參數(shù)Table 1 Some basis physical and chemical parameters of EuACOTS

2.4 EuACOTS基因蛋白結(jié)構(gòu)保守域預(yù)測

利用MEME在線軟件預(yù)測EuACOTS基因家族蛋白結(jié)構(gòu)保守域（見圖3）。在ACOTS基因家族中，除了VvACOT2b、ZmACOT1、ZmACOT3、ZmACOT7之外，其它基因均含有3個結(jié)構(gòu)保守域，且其分布具有一定的規(guī)律性，第2個和第3個保守域均為硫解酶特異保守序列。

2.5 EuACOTS基因家族的蛋白質(zhì)基因跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

利用在線工具TMHMM2.0對EuACOTS家族氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測（見圖4）。EuACOTS家族蛋白無明顯跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外。

圖3 ACOTS基因的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Some conserved domains in ACOTS gene

圖4 EuACOTS蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.4 Predicted transmembrane region of the deduced EuACOTS protein

2.6 EuACOTS基因家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

根據(jù)EuACOTS家族的氨基酸序列，預(yù)測家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（見圖5）。其中EuACOT8蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占40.69%，β折疊占15.44%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占43.87%，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；EuACOT9蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占41.55%，β折疊占14.01%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占44.44%，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；EuACOT10蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占39.95%，β折疊占14.46%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占45.59%，屬于混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。

圖5 EuACOTS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted secondary structure of the deduced EuACOTS protein

2.7 EuACOTS基因家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

采用auto mode建模方式以蛋白模板（2ib8D）對EuACOTS蛋白進(jìn)行同源建模，得到EuACOTS蛋白的三維空間模型（見圖6）。EuACOT8蛋白模型QMEAN 6 得分為0.6，蛋白序列的相似性為49.62%；EuACOT9蛋白模型QMEAN 6 得分為0.58，蛋白序列的相似性為48.09%；EuACOT10蛋白模型QMEAN 6得分為0.57，蛋白序列的相似性為48.23%。EuACOTS家族基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)極為相似。

圖6 EuACOTS蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted tertiary structure of the deduced EuACOTS protein

2.8 EuACOTS基因的內(nèi)含子和外顯子預(yù)測及分析

利用在線軟件GSDS，將杜仲ACOT基因組序列及其對應(yīng)的完整編碼序列（coding sequence CDS）提交到GSDS網(wǎng)站系統(tǒng)，獲得了EuACOTS基因結(jié)構(gòu)示意圖以及外顯子、內(nèi)含子分布圖（見圖7、表2）。EuACOTS基因家族基因組序列含有相同的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量，均為13個外顯子，12個內(nèi)含子，其中內(nèi)含子/外顯子的邊界均符合GTAG 剪切模式，EuACOTS其中7個內(nèi)含子位于0相位，3個內(nèi)含子位于1相位，2個內(nèi)含子位于2相位。

圖7 EuACOTS基因內(nèi)含子和外顯子預(yù)測Fig.7 Prediction of the introns and exons in EuACOTS

表2 EuACOTS外顯子和內(nèi)含子分布序列Table 2 Distribution sequence of the introns and exons in EuACOTS bp

2.9 EuACOTS基因家族啟動子的順式元件作用分析

根據(jù)杜仲基因組測序結(jié)果，得出EuACOTS家族基因組序列，應(yīng)用PLANCE以及PLANT CARE軟件分析其家族啟動子序列（5′UTR 2 000 bp）主要順式元件潛在的分布以及功能。EuACOTS家族基因啟動子主要順式元件潛在的分布以及功能見表3。EuACOTS家族啟動子含有大量基本順式作用元件TATAbox、CAATbox，除此之外還存在光、乙烯、真菌誘導(dǎo)和脫落酸響應(yīng)元件等多個順式調(diào)控元件。其中EuACOT8特有赤霉素和熱脅迫響應(yīng)順式作用元件，EuACOT8可能參與赤霉素誘導(dǎo)以及熱脅迫響應(yīng)基因的調(diào)控；EuACOT9特有茉莉酸響應(yīng)元件，EuACOT9可能受茉莉酸熱脅迫響應(yīng)基因的調(diào)控；而EuACOT10特有生長素響應(yīng)元件，可能參與生長素誘導(dǎo)響應(yīng)基因的調(diào)控。

3 結(jié)論與討論

乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶（AOCT）屬于硫解酶，能催化蛋白質(zhì)的酰基化和去?；?，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性、基因表達(dá)等功能[15,21]。ACOT基因已經(jīng)從大多數(shù)植物中克隆并進(jìn)行了相關(guān)分析，但目前對于杜仲ACOT基因家族的研究并未見報道，文中主要對杜仲ACOT基因家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，EuACTOS基因家族編碼氨基酸為314～406 aa，EuACTOS基因家族編碼氨基酸與其它植物的ACOT基因具有較高的同源性，與其遺傳距離較近的為雙子葉植物葡萄（VvACOT2a、VvACOT2b）以及擬南芥（AtACOT2a），這些基因在結(jié)構(gòu)及特性上相符合，表明EuACTOS基因家族是雙子葉植物ACOT基因，屬于萜類物質(zhì)合成MVA途徑的起始酶。Iván Ahumada[22]提出擬南芥中有2種不同的乙?；D(zhuǎn)移酶AtACOT1和AtACOT2，對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位得知AtACOT1主要定位過氧化物酶中，而AtACOT2主要定位在和細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且AtACOT2的在擬南芥中的相對表達(dá)量較高，得出AtACOT2為萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶，對異戊二烯的生物合成有關(guān)鍵作用。聚類分析結(jié)果表明，EuACTOS基因家族的基因與AtACOT2a及AtACOT2b的遺傳距離較近，更加說明EuACTOS基因家族應(yīng)為萜類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，對杜仲膠的合成應(yīng)有一定的作用。

通過生物信息學(xué)方法分別從核苷酸和蛋白質(zhì)序列水平上，分析了EuACTOS基因家族的序列特征，發(fā)現(xiàn)EuACTO基因編碼蛋白均屬于穩(wěn)定的疏

水蛋白質(zhì)，其二級結(jié)構(gòu)均為螺旋和折疊結(jié)構(gòu)并存的混合結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，均含外顯子13個內(nèi)含子12個，啟動子序列部分含有大量的基本順式作用元件TATAbox，CAATbox以及光、乙烯、真菌誘導(dǎo)和脫落酸響應(yīng)元件等多個順式調(diào)控元件。

表3 EuACOTS基因啟動子區(qū)順式元件作用預(yù)測Table 3 Function prediction of the cis-elements of promoter in EuACOTS

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