于 婷, 付紹平, 肖遠(yuǎn)勝, 薛興亞, 朱靖博

(1.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所,遼寧 大連 116034;2.大連博邁科技發(fā)展有限公司,遼寧 大連 116034;3.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

0 引 言

月季花藥材TLC檢測(cè)項(xiàng)下首次提出以異槲皮苷作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)[1],異槲皮苷是月季花中的主要活性成分之一,經(jīng)國(guó)內(nèi)外研究表明,異槲皮苷具有抗炎[2]、抗氧化[3-4]、降壓[5]、抗病毒[6]等多種藥理活性,常被用作輔助藥物或藥物有效成分給藥,相關(guān)制劑開(kāi)發(fā)前景廣闊。

由于月季花藥材中同時(shí)含有金絲桃苷和異槲皮苷,二者互為同分異構(gòu)體,化學(xué)性質(zhì)極其相似,給大量制備高純的異槲皮苷造成了很大困難。因此本實(shí)驗(yàn)采用高壓水解的方法[7],將蘆丁水解成主要含有蘆丁、異槲皮苷和槲皮素等水解產(chǎn)物,并選用SG64樹(shù)脂柱色譜對(duì)蘆丁的高壓水解產(chǎn)物進(jìn)行分離制備,可以快速得到高純度的異槲皮苷。

1 儀器、試劑與材料

儀器:Ulti Mate3000高效液相色譜儀,美國(guó)戴安公司;UPLC-QTOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)Waters公司;Br uker AVANCE,瑞士Br uker公司,400 MHz;X-5型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀,北京泰克儀器有限公司;水蒸氣反應(yīng)釜,上海德兆儀器儀表有限公司;15 c m×100 c m動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜柱,大連博邁科技發(fā)展有限公司;柱塞計(jì)量泵,杭州之江石化裝備有限公司;5 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申生科技有限公司;MDF反滲透純水機(jī),大連美德環(huán)保設(shè)備有限公司。

試劑與材料:SG64樹(shù)脂,美國(guó)羅門哈斯公司;硅膠薄層板GF254,煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所;醫(yī)用級(jí)蘆丁,陜西森弗生物技術(shù)有限公司;異槲皮苷對(duì)照品,中國(guó)藥科大學(xué)余伯陽(yáng)教授提供;乙腈,色譜純,美國(guó)Fisher公司;甲醇為工業(yè)級(jí),沈陽(yáng)市海洋順化工有限公司;反滲透水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁高壓水解

稱取醫(yī)用級(jí)蘆丁(90%)350 g,加入3倍質(zhì)量水?dāng)嚢璩珊隣?將蘆丁水漿液倒入反應(yīng)釜內(nèi),每次150 mL。控制反應(yīng)釜內(nèi)水蒸氣壓力為0.60 MPa,維持30 min,可制得混合水解物,停止加熱,降溫排汽,將所得水解物真空抽濾,并用4倍質(zhì)量的蒸餾水反復(fù)沖洗,得到固體物質(zhì)230 g。將蘆丁水解產(chǎn)物與異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)于同一GF254薄層板上,以V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)(7∶3∶0.5)作為展開(kāi)劑,噴以0.5%香草醛濃硫酸溶液顯色,結(jié)果如圖1所示。

圖1 蘆丁水解產(chǎn)物的薄層層析圖Fig.1 TLC of hydrolysate of r utin

2.2 分離制備異槲皮苷

將水解產(chǎn)物(230 g)用10%甲醇水溶解,由泵打入裝有處理好的SG64樹(shù)脂的軸向壓縮色譜柱中,以甲醇水(10%～50%)進(jìn)行梯度洗脫,5 L為1個(gè)流份,所得各流份經(jīng)高效液相色譜檢測(cè),在40%甲醇水的(1～26號(hào))流分中含有異槲皮苷樣品,將異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在85%以上的流份合并濃縮,得到異槲皮苷粗品(含蘆丁雜質(zhì))。根據(jù)異槲皮苷和蘆丁在熱水中的溶解性不同,用熱水反復(fù)淋洗異槲皮苷粗品,最終得到異槲皮苷單體化合物。

3 結(jié)果與討論

采用SG64樹(shù)脂柱色譜對(duì)蘆丁水解產(chǎn)物中的異槲皮苷進(jìn)行快速分離,通過(guò)熱水淋洗純化得到15 g較純的異槲皮苷。

3.1 異槲皮苷的純度檢測(cè)

色譜條件,Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)362 n m;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20μL。流動(dòng)相,A為乙腈,B為0.1%甲酸水;梯度洗脫條件:0～5 min,15%A;5～22 min,15%～20%A;22～37 min,20%～40%A;37～42 min,40%A。在所述色譜條件下,分離得到化合物的HPLC如圖2所示,面積歸一化法計(jì)算純度達(dá)98.5%。

圖2 異槲皮苷HPLC圖Fig.2 HPLCchro matogram of isoquercitrin

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

黃色粉末(甲醇),熔點(diǎn)225～227℃,TLC噴硫酸香草醛溶液加熱顯黃色,鹽酸-鎂粉反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。ESI-MS m/z:465[M+H]+,303[M-gl u+H]+。1H-NMR(DMSO,400 MHz)δ:12.64(1 H,s,OH-5),10.90(1 H,s,OH-7),9.77(1 H,s,OH-3′),9.26(1 H,s,OH-4′),7.59(1 H,d,J＝2.5 Hz,H-2′),7.58(1 H,dd,J＝2.0 Hz,J＝8.0 Hz,H-6′),6.85(1 H,d,J＝8.0 Hz,H-5′),6.42(1 H,d,J＝2.0 Hz,H-8),6.22(1 H,d,J＝2.0 Hz,H-6),5.47(1 H,d,J＝7.5 Hz,H-1″),3.08-3.59(6 H,m,Gl ucose pr otons)。13C-NMR(DMSO,400 MHz)δ:177.4(C-4),163.9(C-7),161.2(C-5),156.3(C-9),156.1(C-2),148.3(C-4′),144.7(C-3′),133.3(C-3),121.6(C-1′),121.2(C-6′),116.1(C-5′),115.1(C-2′),104.0(C-10),100.8(C-1″),98.6(C-6),93.5(C-8),77.5(C-5″),76.3(C-3″),74.0(C-2″),69.8(C-4″),60.9(C-6″)。1H-NMR、13C-NMR 光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致,故鑒定化合物為異槲皮苷。

4 結(jié) 論

(1)槲皮素是蘆丁和異槲皮苷的苷元,槲皮素第3個(gè)碳原子上連接一個(gè)蕓香糖基即是蘆丁,去掉蕓香糖中的鼠李糖基,僅1個(gè)葡萄糖與槲皮素相連即為異槲皮苷(其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化如圖3所示)?？刂品磻?yīng)釜內(nèi)水蒸氣壓力為0.60 MPa,維持30 min,水解得到的異槲皮苷最多,當(dāng)反應(yīng)壓力達(dá)到0.80 MPa,維持10 min,蘆丁上的葡萄糖和鼠李糖就會(huì)被同時(shí)水解掉,反應(yīng)將全部轉(zhuǎn)化為槲皮素,而無(wú)法生成異槲皮苷。(2)軸向壓縮色譜柱的柱效高,重現(xiàn)性好,柱內(nèi)壁高度拋光,有效減少了管壁效應(yīng),幾乎可以達(dá)到分析柱的柱效,采用軸向壓縮色譜柱與SG64樹(shù)脂相結(jié)合分離蘆丁的水解產(chǎn)物,分離操作時(shí)間短,樣品處理量大,效果明顯,適合于異槲皮苷對(duì)照品的大規(guī)模制備。

圖3 蘆丁、異槲皮苷和槲皮素結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化Fig.3 Str ucturakl transfor mation a mong r utin,isoquercitrin and quercitin

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