賈艾玲，董金香，姚 雪，王 睿，邱智東

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

冠心病是常見的心血管疾病，發(fā)病率高。臨床發(fā)現(xiàn)，部分冠心病患者伴有“先天伏寒”癥狀[1-4]。雖然治療冠心病的藥物眾多，但是針對兼具“先天伏寒”癥狀的患者有效藥物較少。冠心伏寒顆粒是長春中醫(yī)藥大學(xué)黃永生教授基于已故國醫(yī)大師任繼學(xué)教授的“男女媾精，陽氣不足，寒伏于內(nèi)”病因?qū)W說和20多年治療胸痹證的臨床實(shí)踐總結(jié)出來的用于治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)方劑，由淫羊藿、紅參等10味中藥經(jīng)提取純化而制成，為國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目。該藥在活血化瘀的同時，還能溫補(bǔ)腎陽，與其他的藥物相比，針對性更強(qiáng)。淫羊藿為方中的君藥，具有溫腎壯陽，祛風(fēng)濕, 強(qiáng)筋骨的功效[5-6]。采用高效液相色譜法對制劑中的淫羊藿苷進(jìn)行定量研究，可為評價冠心伏寒顆粒質(zhì)量提供方法。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本島津)；SPD-10Avp紫外檢測器;浙大N 2000色譜工作站；TP-150超聲波清洗機(jī)(天鵬電子新技術(shù)有限公司)；EL-204梅特勒-托利多電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。淫羊藿苷對照品(批號111699-200501)，購自中國藥品生物制品檢定所；冠心伏寒顆粒(批號:20120701，20120702，20120703，均由吉林康奈爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供)；乙腈為色譜純，購自北京博倫凱鑫科技有限公司;水為娃哈哈純凈水；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自吉林省金鑫化玻有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(28∶72)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500[7-8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.040 16 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取粉末(過60目篩)約0.5 g,精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率150 W,頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

2.2.3 陰性對照試驗(yàn) 按處方比例稱取除淫羊藿以外的其余藥材按照制備工藝依法制得缺淫羊藿的陰性對照樣品。按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備淫羊藿陰性對照溶液,按照相應(yīng)的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，所得陰性對照色譜圖中，在與樣品色譜圖中淫羊藿苷峰相同保留時間處無任何色譜峰出現(xiàn)，表明處方中其他藥材對淫羊藿苷的含量測定無影響。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下淫羊藿苷對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，依法測定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，以淫羊藿苷對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。淫羊藿苷的線性回歸方程為:Y=44 233X-2 430.2(r=0.999 9)，表明淫羊藿苷在0.080 32-0.803 2 μg范圍內(nèi),對照品溶液進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下淫羊藿苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得淫羊藿苷峰面積的RSD為1.65%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一淫羊藿苷對照品溶液和供試品溶液各10 μL,分別于0、3、6、12、18、24 h注入高效液相色譜儀，測得供試品溶液及對照品溶液中淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.91%和1.89%，均<3.00%，表明對照品溶液及供試品溶液在24 h內(nèi)均較穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次的樣品(批號:20120701)6分，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測得樣品中淫羊藿苷的含量為1.237 0 mg，RSD為2.31%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號:20120701)6分，每分0.25 g，精密稱定。分別精密加入淫羊藿苷對照品溶液(濃度為0.321 3 mg/mL)1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率為99.05%，RSD為1.29%，表明本品回收率較好。

2.3.6 樣品含量測定 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行測定3批冠心伏寒顆粒中淫羊藿苷的含量。結(jié)果顯示，3批樣品中淫羊藿苷含量分別為1.237 0 mg/g，1.189 2 mg/g，1.345 3mg/g。

2.3.7 3批藥材含量測定 按《中國藥典》2010年版一部淫羊藿項(xiàng)下的含量測定方法[7]，對投料的3批不同廠家淫羊藿藥材(分別購自吉林省宏檢醫(yī)藥藥材有限公司、吉林省同仁大藥房有限公司、吉林大藥房藥業(yè)股份有限公司)進(jìn)行測定。結(jié)果，淫羊藿藥材中淫羊藿苷含量分別為0.55%、0.53%、0.57%。表明3批投料淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量基本穩(wěn)定，均符合《中國藥典》2010年版一部淫羊藿項(xiàng)下規(guī)定。

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)選 本實(shí)驗(yàn)曾對多種流動相進(jìn)行考察，選擇不同比例甲醇-水體系、甲醇-水-冰醋酸體系，發(fā)現(xiàn)色譜柱壓力較高，雜質(zhì)峰較多，峰形較差；改用乙腈-水體系后，淫羊藿苷色譜峰與其余雜質(zhì)峰得到基線分離，峰形好，分離效果較為理想，因此，選擇乙腈-水(28∶72)作為測定制劑中淫羊藿苷的流動相。

3.2 供試品溶液處理方法的優(yōu)選 分別采用水、乙醇、稀乙醇、70%乙醇、甲醇5種提取溶劑處理供試品，結(jié)果表明，甲醇的提取效率最高，能最大限度的提取淫羊藿苷，且在文中所列液相色譜方法下可獲得較為理想的分離效果。

3.3 制劑中淫羊藿苷含量限度的規(guī)定 中藥淫羊藿品種來源復(fù)雜，在前期工藝研究中發(fā)現(xiàn)，市售的淫羊藿藥材很多達(dá)不到《中國藥典》2010年版規(guī)定。淫羊藿苷不得低于0.5%的要求，藥材質(zhì)量之間差異較大，因此，在制藥企業(yè)投料之前需嚴(yán)格控制藥材的質(zhì)量，才能保證制劑的有效性。依據(jù)3批樣品的平均含量，下浮20%，制定冠心伏寒顆粒的含量限度，規(guī)定本品含有淫羊藿苷不得低于1.0 mg/g。

3.4 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)在課題組對制劑提取工藝的研究基礎(chǔ)上，建立了以高效液相色譜法測定冠心伏寒顆粒中淫羊藿苷含量的方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及回收率均符合要求，適合測定淫羊藿苷的含量，可為冠心伏寒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

[1]呂紀(jì)華,賀敏,黃仁彬,等.冠心病中藥治療的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(2):141-143.

[2]李素英.冠心病的治療進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生,1992(2):5-8.

[3]黃永生,郭家娟,鄧悅.先天伏寒證理論內(nèi)涵及其對臨床指導(dǎo)意義[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2007,21(6):3-4.

[4]孫媛.試談活血化瘀法治療冠心病[J].新中醫(yī),2011,43(12):128-129.

[5]Xie JP,Sun WJ.Pharmacological Advance in Study on Epimedi-um Chemical constituents[J].Strait Pharmaceutical Journal,2006,18(5):17-20.

[6]黃兆勝.中藥學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:309.

[7]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:307.

[8]張榮泉,王蓮,米沙,等.HPLC法測定藿精片中淫羊藿苷含量[J].天津藥學(xué),2011,23(1):7-8.