李東亞，鄭 欣，陳一心

由損傷、感染、骨腫瘤術后等原因造成的大段骨缺損，其臨床治療方法包括骨延長術［1］、帶血管蒂骨移植術［2］等，其中最佳治療方法是骨移植，但由于自體骨移植供骨量有限且存在取骨區(qū)感染風險，而同種異體骨移植存在傳染疾病的可能［3］，使得骨移植的應用受到限制。1995年 Crane等［4］提出骨組織工程概念，即應用工程學和生命科學的手段，將種子細胞種植到天然或人工合成的支架材料、細胞外基質上，然后將復合細胞的支架材料植入到骨缺損部位，在支架材料降解的同時，種子細胞增殖分化為成骨細胞，從而修復骨缺損。骨組織工程的3個關鍵要素是支架材料、種子細胞和生物活性因子。根據(jù)其來源的不同，骨組織工程支架材料主要分為人工合成無機材料、人工合成高分子材料和天然生物衍生材料3種。近年來骨組織工程支架材料的設計及制作技術發(fā)展迅速，本文就幾種典型的支架材料應用于大段骨缺損的實驗研究進展作一綜述。

1 磷酸三鈣 (tricalcium phosphate，TCP)

TCP的化學式為 Ca3(PO4)2，按結構分為高溫相(α-TCP)和低溫相(β-TCP)。β-TCP具有良好的生物相容性、骨引導作用和可降解性能，利于宿主的細胞和血管長入材料，在形成新骨的同時材料被逐步降解吸收，從而完成新骨的“爬行替代”過程，在大段骨缺損的修復中主要應用β-TCP。由于其缺乏骨誘導性，多采用具有骨誘導性的自體骨髓［5］、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP)［6］等與其復合使用。Erbe 等［5］認為，由于自體骨移植時供血延遲可造成移植骨死亡，而β-TCP多孔生物陶瓷的多孔結構更利于血管化和細胞的營養(yǎng)供應，β-TCP/自體骨髓復合材料在促進新生骨供血方面比自體松質骨移植效果更好。Busuttil等［7］比較了 rhBMP-7/β-TCP復合材料和單獨應用β-TCP材料修復兔顱骨骨缺損時的成骨能力。在材料置入骨缺損3個月后處死動物，組織學檢查發(fā)現(xiàn)rhBMP-7/β-TCP復合材料組再生骨量占總缺損骨量的平均百分比為(29.41±6.25)%，遠高于單獨應用β-TCP材料組;力學性能檢測發(fā)現(xiàn)，rhBMP-7/β-TCP復合材料組遠較單獨應用β-TCP材料組好，其中應用復合材料的某些個體，其新生骨力學性能甚至與正常骨相當，可見rhBMP-7/β-TCP復合材料組在修復骨缺損時更有優(yōu)勢。但亦有生長因子與β-TCP復合后，不能表現(xiàn)出良好的修復骨缺損能力，如轉化生長因子 β3(transforming growth factor-β3 ，TGF-β3)等［8］。

提高TCP的骨誘導性不僅可通過復合細胞因子實現(xiàn)，還可通過聯(lián)合應用種子細胞實現(xiàn)。E等［6］研究了復合鼠脂肪基質細胞(rat-adipose-derived stromal cells，rASCs)和rhBMP-2的β-TCP復合材料在骨組織工程的應用。他們評估復合材料修復骨缺損能力的指標包括，細胞附著能力、堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量、鈣磷含量、基因表達等。分組實驗的研究結果表明，β-TCP可促進鼠脂肪基質細胞向成骨細胞表型分化，材料中復合的生物活性因子rhBMP-2能顯著增加培養(yǎng)在β-TCP上的rASCs中鈣磷含量，堿性磷酸酶活性，骨鈣素mRNA水平、I型膠原含量等，因此rASCs/rhBMP-2/β-TCP復合材料修復骨缺損時再生骨量最多，修復骨缺損具有更大的優(yōu)勢。

盡管目前修復骨缺損的動物實驗中多應用β-TCP，然而也有學者認為［9］，在復合材料中α-TCP較β-TCP有更好的成骨能力。他們在比較 α-TCP、β-TCP、羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)等3種支架材料修復 Wistar大鼠直徑5mm的顱骨骨缺損時，將3種材料復合辛伐他汀，辛伐他汀可以刺激rhBMP-2表達，micro-CT檢查結果表明3種支架材料復合辛伐他汀組均較不復合組有更好的成骨效果，而復合辛伐他汀同時也影響了α-TCP和β-TCP的降解，α-TCP較β-TCP具有更高的降解率而骨再生更多，復合辛伐他汀的α-TCP更加增強了這種優(yōu)勢。

2 羥基磷灰石 (hydroxyapatite，HA)

HA是最穩(wěn)定的磷酸鈣形式之一，其化學式為 Ca10(PO4)6(OH)2，是常見的生物活性材料。HA用于骨組織工程修復大段骨缺損的優(yōu)點是較好的生物相容性、骨傳導性、可降解性。有學者［10］在動物實驗中發(fā)現(xiàn)HA修復骨缺損的效果與自體骨移植相當，不過HA缺點是很脆，拉伸性很差。HA作為骨組織工程支架材料應該具備合適的孔隙率以利于新的骨組織生成及機體微環(huán)境交換，具備適宜的表面以利于細胞附著、遷移、擴散，因此多孔結構的支架材料應用較多。Heo等［11］應用冷凍干燥技術，制作新型納米級(HA顆粒直徑20～90納米)和微米級(HA顆粒直徑20～80μm)的HA/聚己內酯復合支架;盡管兩種材料均為高度多孔材料，具有相似的孔徑和孔隙率(72% ～73%)，然而其顆粒直徑的顯著不同造成顯著差異的機械性能。兩者彈性模量分別是(3.187±0.06)兆帕和(1.345±0.05)兆帕，前者的彈性模量明顯大于后者，表現(xiàn)出更好的機械性能。Heo等［12］進一步應用電子掃描顯微鏡、組織染色等比較上述納米級和微米級HA/聚己內酯復合支架的成骨效果，發(fā)現(xiàn)前者較后者更易黏附和增殖間充質干細胞，骨缺損處有更多的鈣和堿性磷酸酶，可見納米級較微米級HA支架修復骨缺損時更有優(yōu)勢。目前已有臨床應用的報道證實，納米級HA/膠原復合材料應用于臨床口腔科治療牙周骨缺損時較開放皮瓣清創(chuàng)術效果更好。

與其他生物材料不同，納米級HA復合金屬材料還具有較好的抗菌功能［13-14］。Sahithi等［14］通過掃描電鏡、紅外光譜和X射線衍射技術合成和表征納米級HA和納米級HA/Cu復合材料，并在兩種材料上接種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌，比較菌株數(shù)后發(fā)現(xiàn)納米級HA/Cu復合材料具有較好的抗菌能力，而且復合聚乙二醇400的納米級HA/Cu材料表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌更好的抗菌效果，該研究還證實了聚乙二醇400-納米級HA/Cu復合材料不具有細胞毒性。

3 聚己內酯 (polycaprolactone，PCL)

聚己內酯屬半結體聚酯，易溶于有機溶劑，具有良好的生物相容性，穩(wěn)定的物理和機械屬性［15］，是一種被廣泛關注的高分子合成材料。但是聚己內酯在機械強度、生物活性及骨誘導能力方面仍有不足［16］，骨組織工程中亦多應用其復合材料。Reichert等［17］比較了PCL-TCP和HA-SF(silk fibroin，SF)與自體骨髓移植治療羊脛骨大段骨缺損時的成骨效果;術后12周，X射線，扭轉測試和定量計算機斷層掃描分析表明，骨缺損在自體骨髓移植組完全橋接，在PCL-TCP組部分橋接，而HA-SF組僅有少量骨生成;生物力學測試顯示，PCL-TCP組和自體骨髓移植組的新生骨扭矩/剛度值之間無顯著差異;他們認為結合成骨細胞或生長因子的PCLTCP材料將表現(xiàn)出更好的修復骨缺損能力。Cai等［18］將人類胚胎干細胞來源的間充質干細胞種植在L-乳酸-聚己內酯復合材料上，修復兔脛骨骨缺損，X線和組織學檢測證實了支架內外有較多新骨生成。Laird等［19］研究了燒結牛松質骨化學滲透PCL后的機械性能，機械壓縮試驗表明燒結牛松質骨化學滲透PCL后彈性模量增加，PCL可優(yōu)化燒結牛松質骨在骨移植中的應用。

4 殼聚糖 (chitosan，CTS)

殼聚糖屬于天然生物衍生物，化學名為(1，4)聚-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，可通過化學法和酶解法獲得，是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，而甲殼素是甲殼類動物外骨骼的主要組成部分。因而殼聚糖除了具有較好的骨傳導性，還有良好的生物相容性，但是其機械強度較差［20］。由于碳納米管具有高楊氏模量、高抗拉強度和高斷裂伸長率［21］，人們研制出了碳納米管復合殼聚糖天然聚合物材料以增加機械強度［22］，當0.8%的碳納米管均勻地分散在整個CTS矩陣時，復合材料較單純殼聚糖的拉伸模量和機械強度提高了約93%和99%。為進一步提高殼聚糖的力學性能和生物相容性，Kavya等［20］將殼聚糖與硫酸軟骨素及納米級二氧化硅復合，復合支架材料表現(xiàn)出豐富的孔隙率、生物降解性、機械完整性、礦化和蛋白質可吸附性;而且涂布纖維蛋白的該納米支架能更好地黏附細胞，這種新型復合材料支架較為適合應用于骨組織工程。動物實驗研究表明［18］，可注射性納米羥基磷灰石/殼聚糖復合支架修復大段骨缺損效果很好，他們在新西蘭大白兔左股骨髁處制作直徑6mm，長10mm的大段骨缺損，術后12周，應用納米羥基磷灰石/殼聚糖組的骨缺損完全愈合，而單純應用殼聚糖組的骨缺損愈合尚不完全。

為了從基因水平探討殼聚糖單體影響成骨的過程，Ganno等［23］利用低濃度殼聚糖單體培養(yǎng)成骨細胞。殼聚糖單體誘導絲裂原活化蛋白激酶及堿性磷酸酶基因等4個信號轉導基因表達的增加。低濃度的殼聚糖單體直接影響成骨細胞內的信號轉導mRNA水平，調節(jié)成骨細胞的活性。鑒于生物活性因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等在成骨中具有重要作用，可將該類因子與殼聚糖聯(lián)合應用，Si等［24］應用基因工程技術，將轉染了VEGF的骨髓基質干細胞種植在納米級HA/羥甲基殼聚糖復合支架上，用于修復兔橈骨骨缺損;術后12周，復合材料組已經(jīng)有較多新骨生成;術后24周，新骨生成較12周時明顯增多，同時復合材料僅有較少的殘存，大部分已降解。雖然應用基因工程，殼聚糖復合材料修復骨缺損效果較好，但尚未得到臨床應用。

5 絲素蛋白(silk fibroin，SF) 絲素蛋白是一種可降解的生物大分子，其化學結構和力學性能可調，骨再生能力良好，可作為理想的骨組織工程支架材料［25］。絲素蛋白較高分子聚合材料的優(yōu)點包括:具有水溶性使得制作支架材料過程中可避免使用有毒的有機溶劑，同時具有可控的生物降解性有利于骨細胞順利長入支架材料［26］。但其機械性能不佳，常選用具備較高機械性能的材料與其復合應用于骨組織工程。

鑒于生物活性玻璃具有較好的機械性能，Wu［27］等比較了多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料、普通生物活性玻璃/絲素蛋白材料與單純絲素蛋白修復骨缺損時的成骨能力，實驗中骨缺損動物模型為免疫缺陷小鼠3mm直徑全層顱骨骨缺損。3種材料具有相似的孔隙率(約75%)，術后8周處死小鼠，缺損處行micro-CT掃描以及組織學分析，結果表明多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料的新生骨量較其他兩組多，他們認為多孔生物活性玻璃/絲素蛋白材料非常適合做組織工程生物活性支架。該試驗同時反映了單純使用絲素蛋白修復骨缺損的效果有限。但并不是所有的絲素蛋白復合材料的成骨能力都是良好的，Kweon等［28］在比較納米級HA復合絲素蛋白與單純納米級HA修復兔直徑8mm顱骨骨缺損的成骨能力，發(fā)現(xiàn)術后8周應用組織計量學測得單純納米級羥基磷灰石的骨再生比率(40.16±8.27)%遠遠高于空白對照組(25.66±10.98)%和復合材料組(16.62±3.05)%，這表明復合材料的應用仍有很多需要改進的地方，如復合材料的孔徑及孔隙率的控制等。

孔隙結構的優(yōu)化可顯著改善絲素蛋白支架材料的成骨效果，Zhang等［29］應用冷凍干燥技術，制作了4組孔徑在50～300μm之間的三維絲素蛋白支架，并將轉染BMP-7基因的人骨髓基質干細胞培養(yǎng)在這4組支架，然后置入免疫抑制小鼠的骨缺損處，觀察其成骨反應。他們應用細胞活力比色法、堿性磷酸酶檢測和逆轉錄-聚合酶鏈反應分析孔徑對細胞的生長和成骨細胞分化的影響。結果表明，轉染BMP7的骨髓基質干細胞在孔徑為100～300μm的三維絲素蛋白支架上生長良好，有較多新生骨組織出現(xiàn)，可見優(yōu)化孔隙結構的三維絲素蛋白支架可以調節(jié)BMP7轉染的骨髓基質干細胞在骨形成過程中的生物活性。有報道指出［30］，堿性水解法獲得的微米級絲素纖維(10～600μm)，其抗壓強度可達13兆帕，而且這種方法獲得的絲素材料表面粗糙、多孔、高硬度，適合于骨髓基質干細胞向骨樣組織分化及骨標記基因表達，同時該材料在體內實驗表現(xiàn)出較低的免疫反應。

雖然系統(tǒng)的骨組織工程學研究歷史不長，但骨組織工程支架材料的制備方法和制備技術都已有了長足進步，如納米技術、基因工程等，多種新型復合骨組織工程支架材料在動物試驗中修復大段骨缺損的效果得到肯定。但是目前對細胞與骨組織工程支架材料的相互作用研究還停留在細胞水平。隨著骨組織工程研究的不斷深入，相信骨組織工程支架材料能更加完善地結合種子細胞、生物活性因子以高效地修復大段骨缺損。在不久的將來，骨組織工程支架定會在大段骨缺損的臨床治療中發(fā)揮重要作用。

［1］ Dincyurek H，Kocaoglu M，Eralp IL，et al.Functional results of lower extremity lengthening by motorized intramedullary nails［J］.Acta Orthop Traumatol Turc，2012，46(1):42-49.

［2］ Soucacos PN，Dailiana Z，Beris AE，et al.Vascularised bone grafts for the management of non-union［J］.Injury，2006，37(S1):S41-50.

［3］ Giannoudis PV，Dinopoulos H，Tsiridis E.Bone substitutes:an update［J］.Injury，2005，36(S3):S20-27.

［4］ Crane GM，Ishaug SL，Mikos AG.Bone tissue engineering［J］.Nat Med，1995，1(12):1322-1324.

［5］ Erbe EM，Marx JG，Clineff TD，et al.Potential of an ultraporous betatricalcium phosphate synthetic cancellous bone void filler and bone marrow aspirate composite graft［J］.European Spine J，2001，10(S1):S141-146.

［6］ E LL，Xu LL，Wu X，et al.The interactions between rat-adiposederived stromal cells，recombinant human bone morphogenetic protein-2，and beta-tricalcium phosphate play an important role in bone tissue engineering［J］.Tissue Eng Part A，2010，16(9):2927-2940.

［7］ Busuttil Naudi K，Ayoub A，McMahon J，et al.Mandibular reconstruction in the rabbit using beta-tricalcium phosphate(beta-TCP)scaffolding and recombinant bone morphogenetic protein 7(rhBMP-7)-Histological，radiographic and mechanical evaluations［J］.J Craniomaxillofac Surg，2012，40(5):427-434.

［8］ Damron TA.Use of 3D beta-tricalcium phosphate(Vitoss)scaffolds in repairing bone defects［J］.Nanomedicine(Lond)，2007，2(6):763-775.

［9］ Rojbani H，Nyan M，Ohya K，et al.Evaluation of the osteoconductivity of alpha-tricalcium phosphate，beta-tricalcium phosphate，and hydroxyapatite combined with or without simvastatin in rat calvarial defect［J］.J Biomed Mater Res A，2011，98(4):488-498.

［10］ Chaves MD，de Souza Nunes LS，de Oliveira RV，et al.Bovine hydroxyapatite(Bio-Oss((R)))induces osteocalcin，RANK-L and osteoprotegerin expression in sinus lift of rabbits［J］.J Craniomaxillofac Surg，2012，40(5):459-463.

［11］ Heo SJ，Kim SE，Wei J，et al.Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process［J］.J Biomed Mater Res A，2009，89(1):108-116.

［12］ Heo SJ，Kim SE，Wei J，et al.In vitro and animal study of novel nano-hydroxyapatite/poly(epsilon-caprolactone)composite scaffolds fabricated by layer manufacturing process［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(5):977-989.

［13］ Swetha M，Sahithi K，Moorthi A，et al.Synthesis，characterization，and antimicrobial activity of nano-hydroxyapatite-zinc for bone tissue engineering applications［J］.J Nanosci Nanotech，2012，12(1):167-172.

［14］ Sahithi K，Swetha M，Prabaharan M，et al.Synthesis and characterization of nanoscale-hydroxyapatite-copper for antimicrobial activity towards bone tissue engineering applications［J］.J Biomed Nanotechnol，2010，6(4):333-339.

［15］ Cancedda R，Dozin B，Giannoni P，et al.Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone［J］.Matrix Biol，2003，22(1):81-91.

［16］ Rezwan K，Chen QZ，Blaker JJ，et al.Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Biomaterials，2006，27(18):3413-3431.

［17］ Reichert J，Epari D，Wullschleger M，et al.Bone tissue engineering:reconstruction of critical sized segmental bone defects in the ovine tibia［J］.Orthopade，2012，41(4):280-287.

［18］ Cai Y，Zhang G，Wang L，et al.Novel biodegradable three-dimensional macroporous scaffold using aligned electrospun nanofibrous yarns for bone tissue engineering［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100(5):1187-1194.

［19］ Laird D，Mucalo M，Dias G.Vacuum-assisted infiltration of chitosan or polycaprolactone as a structural reinforcement for sintered cancellous bovine bone graft［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100A(8):2018-2026.

［20］ Kavya KC，Dixit R，Jayakumar R，et al.Synthesis and characterization of chitosan/chondroitin sulfate/nano-SiO2composite scaffold for bone tissue engineering［J］.J Biomed Nanotechnol，2012，8(1):149-160.

［21］ Samal SS，Bal S.Carbon nanotube reinforced ceramic matrix composites:a review［J］.J Minerals Materials Characterization Engin，2008，7(4):355-370.

［22］ Wang SF，Shen L，Zhang WD，et al.Preparation and mechanical properties of chitosan/carbon nanotubes composites［J］.Biomacromolecules，2005，6(6):3067-3072.

［23］ Ganno T，Yamada S，Ohara N，et al.Early gene expression analyzed by cDNA microarray and real-time PCR in osteoblasts cultured with chitosan monomer［J］.J Biomed Materials Res，2007，82A(1):188-194.

［24］ Si HP，Lu ZH，Lin YL，et al.Transfect bone marrow stromal cells with pcDNA3.1-VEGF to construct tissue engineered bone in defect repair［J］.Chin Med J(Engl)，2012，125(5):906-911.

［25］ Park SH，Gil ES，Kim HJ，et al.Relationships between degradability of silk scaffolds and osteogenesis［J］.Biomaterials，2010，31(24):6162-6172.

［26］ Zhao J，Zhang Z，Wang S，et al.Apatite-coated silk fibroin scaffolds to healing mandibular border defects in canines［J］.Bone，2009，45(3):517-527.

［27］ Wu C，Zhang Y，Zhou Y，et al.A comparative study of mesoporous glass/silk and non-mesoporous glass/silk scaffolds:physiochemistry and in vivo osteogenesis［J］.Acta Biomater，2011，7(5):2229-2236.

［28］ Kweon H，Lee KG，Chae CH，et al.Development of nanohydroxyapatite graft with silk fibroin scaffold as a new bone substitute［J］.J Oral Maxillofac Surg，2011，69(6):1578-1586.

［29］ Zhang Y，F(xiàn)an W，Ma Z，et al.The effects of pore architecture in silk fibroin scaffolds on the growth and differentiation of mesenchymal stem cells expressing BMP7［J］.Acta Biomater，2010，6(8):3021-3028.

［30］ Mandal BB，Grinberg A，Seok Gil E，et al.High-strength silk protein scaffolds for bone repair［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(20):7699-7704.