王 璐，張 鵬，劉紅菊，許壽生，陳曉萍△

（1．中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京100094；2．北京體育大學(xué)，北京100084）

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是由α、β和γ亞單位構(gòu)成的異源三聚體，在整個(gè)機(jī)體的能量代謝過程中起著中心控制作用，是真核生物能量代謝變化的感受器。以往研究證明，無論在一次性運(yùn)動還是在長期耐力訓(xùn)練中，肌肉收縮所引起的能量變化（AMP上升，ATP下降）［1］均可以激活 AMPK，p-AMPKα表達(dá)增加［2］。本研究利用小鼠跑臺實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測了AMPKα亞基在運(yùn)動過程中不同纖維類型骨骼肌中的動態(tài)表達(dá)，為闡明AMPKα亞基在骨骼肌運(yùn)動過程中的重要作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

本實(shí)驗(yàn)選用8周齡健康雄性 C57BL／6小鼠18只，體重（20±1）g（北京維通利華公司購買），常規(guī)分籠飼養(yǎng)，室溫保持在（23±2）℃，光照12 h／d，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由飲食。預(yù)適應(yīng)一周，隨機(jī)分為三組（n＝6）：對照組（運(yùn)動前）、運(yùn)動中（運(yùn)動1 h后）和運(yùn)動耗竭。

1．2 小鼠跑臺實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法［1］將小鼠放入跑臺，水平狀態(tài)下每天以10 m／min運(yùn)動15 min，預(yù)適應(yīng)一周后，運(yùn)動前組直接取小鼠后肢背側(cè)腓腸肌、比目魚肌以及跖肌。運(yùn)動中、運(yùn)動耗竭組小鼠放入跑臺以水平狀態(tài)15 m／min的速度進(jìn)行運(yùn)動，并分別在運(yùn)動1 h后和運(yùn)動耗竭時(shí)取小鼠后肢背側(cè)腓腸肌、比目魚肌以及跖肌，提取總蛋白［2］。

1．3 主要試劑

AMPKα（Cell signaling，2532），p-AMPKα（Cell signaling，2531S），beta-actin（北京中山生物公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（北京中山生物公司）。

1．4 Western blot

（1）取50～100 mg組織加入到1 ml組織裂解液中（已加入蛋白酶抑制劑），用勻漿器在冰上充分勻漿，冰上裂解30 min；（2）4℃，12 000×g離心 20 min，取上清，取標(biāo)準(zhǔn)溶液和適當(dāng)稀釋的待測樣品各20μl，加入5倍稀釋的蛋白濃度分析試劑中，595 nm波長測光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度的光密度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品蛋白濃度；（3）分別配制12%的分離膠和5%的積層膠，灌制分離膠和積層膠，在樣品加入凝膠加樣緩沖液，沸水變性3～5 min后每孔80μg上樣；（4）電泳：恒壓電泳，電泳至凝膠底部；取下凝膠，放入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10 min；（5）NC膜在預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10 min，在濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀上以恒流進(jìn)行電轉(zhuǎn)；（6）電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于TBS中漂洗3次，每次10 min。封閉，室溫輕搖2 h。剪下目的條帶，按照0．1 ml／cm2的比例分別加入用封閉液稀釋的抗AMPKα、p-AMPKα一抗，4℃輕搖過夜；（7）TBST洗 3次，每次10 min。按照0．1 ml／cm2的比例加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，在室溫振蕩2 h。（8）TBST洗3次，每次10 min，ECL顯色。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Image-Pro Plus灰度分析后，利用SPSS11．0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差x±s）表示，兩組間比較行 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 AMPKα及p-AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中腓腸肌中的表達(dá)變化

Western blot的結(jié)果顯示，同對照組（運(yùn)動前組）對比，AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中腓腸肌中的表達(dá)并無太大變化；而p-AMPKα在運(yùn)動1h后直至耗竭表達(dá)持續(xù)增多，分別為對照組的 2．14倍和 3．23倍（P＜0．01，圖 1）。

2．2 AMPKα及p-AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中比目魚肌中的表達(dá)變化

同對照組（運(yùn)動前組）對比，AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中比目魚肌中的表達(dá)也沒有太大變化；而p-AMPKα在運(yùn)動1 h后表達(dá)增加至對照組的4．18倍，至運(yùn)動耗竭時(shí)略為下降，但仍遠(yuǎn)比對照組表達(dá)較高，為對照組的3．8倍（P＜0．01，圖2）。

Fig．1 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin gastrocnemius of mice during exercise（ˉx±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group**P＜0．01 vs control group

Fig．2 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin soleus muscles of mice during exercise（ˉx±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group**P＜0．01 vs control group

2．3 AMPKα及p-AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中跖肌中的表達(dá)變化

同對照組（運(yùn)動前組）對比，AMPKα在小鼠運(yùn)動過程中跖肌中的表達(dá)也沒有太大變化；而p-AMPKα在運(yùn)動1 h后表達(dá)增加至對照組的2．51倍，至運(yùn)動耗竭時(shí)下降至對照組1．5倍（P＜0．05，P＜0．01，圖 3）。

Fig．3 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin plantaris muscles of mice during exercise（ˉx±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group*P＜0．05，**P＜0．01 vs control group

3 討論

AMPK作為骨骼肌內(nèi)重要的能量感受器［1］，對于維持骨骼肌運(yùn)動時(shí)的能量供應(yīng)至關(guān)重要。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，小鼠運(yùn)動1 h直至運(yùn)動耗竭，在AMPKα蛋白表達(dá)水平基本保持不變的情況下，p-AMPKα在小鼠后肢背側(cè)腓腸肌、比目魚肌和跖肌中的表達(dá)均顯著增加。

p-AMPKα的表達(dá)增加可以磷酸化下游與骨骼肌有氧代謝過程相關(guān)眾多關(guān)鍵限速酶。研究表明，激活的AMPK可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增加及其向胞膜的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取，激活糖酵解途徑的限速酶促進(jìn)葡萄糖在體內(nèi)的分解代謝［2］；激活的AMPK也可以磷酸化ACC抑制脂肪酸的合成，并通過NRF和PGC-1α促進(jìn)線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈活動性增強(qiáng)；還可以抑制蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)分解［4］。因此，運(yùn)動時(shí)p-AMPKα表達(dá)增加的意義在于，通過促進(jìn)產(chǎn)能的分解代謝，抑制耗能的合成代謝來保證運(yùn)動時(shí)骨骼肌的能量供應(yīng)。遺傳學(xué)的證據(jù)同樣證明，AMPKα亞型失活可使小鼠最大運(yùn)動速度下降45%，運(yùn)動時(shí)間減少55%［5］。轉(zhuǎn)基因動物的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了AMPK對于保證運(yùn)動時(shí)骨骼肌的能量供應(yīng)的重要性。

研究中我們還發(fā)現(xiàn)，p-AMPKα在小鼠后肢肌肉中的表達(dá)變化尤其以比目魚肌中最為顯著，在跖肌中的表達(dá)變化幅度最小。骨骼肌按照本身的代謝類型特性可分為慢肌和快肌，分別由慢肌纖維蛋白和快肌纖維蛋白組成。慢肌又稱為紅肌，以有氧代謝為主，收縮緩慢、持久，不易產(chǎn)生疲勞，比目魚肌為典型的慢??；快肌也稱白肌，以無氧酵解代謝為主，收縮快，爆發(fā)力強(qiáng)，但容易出現(xiàn)疲勞，跖肌是典型的快肌。相對于快肌跖肌，p-AMPKα在慢肌比目魚肌中的顯著變化能夠充分激活下游的有氧代謝反應(yīng)，以便快速供應(yīng)肌肉能量。因此，p-AMPKα在運(yùn)動過程中不同纖維類型肌肉中的變化差異可能與肌肉自身的代謝特征有關(guān)，相同的運(yùn)動強(qiáng)度和運(yùn)動方式對不同纖維類型的肌肉影響程度并不相同。這也提示，對不同專項(xiàng)運(yùn)動員、身體不同部位肌肉進(jìn)行有針對性的訓(xùn)練可大大提高訓(xùn)練效率。

因此，在本研究中，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了運(yùn)動時(shí)AMPK對于保證骨骼肌的能量供應(yīng)的重要性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)相同的運(yùn)動強(qiáng)度和運(yùn)動方式對不同纖維類型的肌肉影響幅度并不相同。進(jìn)一步闡明AMPK各亞基在骨骼肌運(yùn)動過程中的重要作用，對于指導(dǎo)運(yùn)動員進(jìn)行針對性訓(xùn)練，提高運(yùn)動鍛煉效果具有重要的實(shí)際意義。

［1］ Narkar V A，Downes M，Yu R T，et al．AMPK and PPAR agonists are exercise mimetics［J］．Cell，2008，134（3）：405-415．

［2］ Ljubicic V，Miura P，Burt M，et al．Chronic AMPK activation evokes the slow，oxidative myogenic program and triggers beneficial adaptations in mdx mouse skeletal muscle［J］．Hum Mol Genet，2011，20（17）：3478-3493．

［3］ Lee-Young R S，Ayala JE，F(xiàn)ueger PT，et al．Obesity impairs skeletal muscle AMPK signaling during exercise：role of AMPKα2 in the regulation of exercise capacity in vivo［J］．Int J Obes（Lond），2011，35（7）：982-989．

［4］ Iversen N，Krustrup P，Rasmussen H N，et al．Mitochondrial biogenesis and angiogenesis in skeletal muscle of the elderly［J］．Exp Gerontol，2011，46（8）：670-678．

［5］ Jorgensen SB，Treebak JT，Viollet B，et al．Role of AMPKalpha2 in basal，training-，AICAR-induced GLUT4，hexokinase II，and mitochondrial protein expression in mouse muscle［J］．Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292（1）：E331-E339．