趙 佩，牛爭平，劉平平，雷小峰，楊清和

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)血管性頭痛，患病率約為15%［1］。世界衛(wèi)生組織將嚴(yán)重偏頭痛定性為最致殘的慢性疾病之一，其發(fā)作類同于癡呆、四肢癱瘓和嚴(yán)重精神?。?］。本研究觀察養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒的影響，探討偏頭痛的發(fā)病機(jī)制及養(yǎng)血清腦顆粒防治偏頭痛的作用環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠108只，體重250 g～300 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，安靜屏障環(huán)境喂養(yǎng)。硝酸甘油注射液：造模藥物，由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字 H11020289，產(chǎn)品批號(hào)：20120601）。養(yǎng)血清腦顆粒天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z10960082，產(chǎn)品批號(hào)：120208），每袋4 g，用蒸餾水配制成高劑量養(yǎng)血清腦顆粒溶液（0.32 g／m L）及低劑量養(yǎng)血清腦顆粒溶液（0.16 g／mL）備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組 將108只健康雄性Wistar大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、治療高劑量組、治療低劑量組、預(yù)防高劑量組及預(yù)防低劑量組，各組再隨機(jī)分為30 min、60 min、180 min組，分別于造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠切取標(biāo)本。根據(jù)Tassorelli［3］皮下注射硝酸甘油建立大鼠偏頭痛模型。正常對(duì)照組予皮下注射生理鹽水，大鼠出現(xiàn)短時(shí)間的、次數(shù)不多的撓頭、爬籠動(dòng)作，未見耳紅。治療高、低劑量組大鼠在造模后10 min分別灌胃高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒1次，預(yù)防高、低劑量組大鼠在造模前分別灌胃高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒7 d。

1.2.2 標(biāo)本制備 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、治療高劑量組、治療低劑量組、預(yù)防高劑量組及預(yù)防低劑量組的30 min、60 min、180 min亞組于造模后灌注固定。于撓頭明顯側(cè)剪取2塊硬腦膜組織，將其投入4%多聚甲醛（p H 7.4，4℃）過夜固定，第二天行石蠟包埋切片，每張4μm，連續(xù)切片5張。根據(jù)趙汝香等［4］所述的Brandon改良甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)肥大細(xì)胞進(jìn)行特染。計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞（MCs）總數(shù)和脫顆粒數(shù)目（胞膜出現(xiàn)明顯破裂或有顆粒外逸為脫顆粒）。計(jì)算肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。各組間先行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。在各組總體方差相等的情況下，采用單因素的方差分析，各組間比較用LSD-t比較。分析給藥順序、劑量、時(shí)間的交互效應(yīng)采用析因設(shè)計(jì)方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察 通過對(duì)大鼠各時(shí)段爬籠、撓頭、咬趾、往返等行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組在造模后30 min內(nèi)偏頭痛相關(guān)行為明顯多于其他時(shí)間段，考慮為給藥操作激惹所致。治療高、低劑量組各時(shí)段與模型對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），預(yù)防高、低劑量組與模型對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率 鏡下可見肥大細(xì)胞多分布于血管周圍，呈圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)充滿嗜堿性顆粒，被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)紫色或紫紅色，其中部分肥大細(xì)胞膜破裂，可見紫紅色顆粒逸出細(xì)胞外，甚至喪失原有的細(xì)胞形態(tài)，僅見呈爆裂樣成簇分布的紫紅色顆粒。詳見表1。

表1 治療組與對(duì)照組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MC脫顆粒陽性率（±s） %

表1 治療組與對(duì)照組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MC脫顆粒陽性率（±s） %

組別 n 30 min 60 min 180 min正常對(duì)照組6 10.60±6.46 9.95±3.85 11.38±4.00模型對(duì)照組 6 45.53±4.54 56.70±3.60 64.49±3.44治療高劑量組 6 45.46±4.76 58.23±3.88 67.69±4.99治療低劑量組 6 47.05±6.19 59.53±3.55 66.44±3.19 F值 61.145 252.131 287.659 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001注：組間多重比較LSD-t在α＝0.05，P＜0.05。

表2 預(yù)防組與對(duì)照組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MC脫顆粒陽性率±s） %

表2 預(yù)防組與對(duì)照組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MC脫顆粒陽性率±s） %

組別 n 30 min 60 min 180 min正常對(duì)照組6 10.60±6.46 9.95±3.85 11.38±4.00模型對(duì)照組 6 45.53±4.54 56.70±3.60 64.49±3.44預(yù)防高劑量組 6 24.92±4.95 30.66±4.80 53.94±2.30預(yù)防低劑量組 6 26.50±6.59 33.13±5.34 52.62±4.75 F值 37.876 110.676 236.988 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001注：組間多重比較L SD-t在α＝0.05，P＜0.05。

表3 大鼠MC脫顆粒陽性率2×2×3析因試驗(yàn)方差分析表

3 討 論

1983年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［5］，肥大細(xì)胞可能參與偏頭痛的發(fā)病過程，流行病學(xué)研究顯示患有MC相關(guān)疾?。ㄈ缦裾?、鼻炎及間質(zhì)性膀胱炎）的患者中偏頭痛發(fā)病率明顯增高，MC與偏頭痛密切聯(lián)系［6］，硬腦膜或大腦的肥大細(xì)胞可能參與發(fā)作過程。肥大細(xì)胞起源于遠(yuǎn)處骨髓中的祖先細(xì)胞，通過軟腦膜進(jìn)入腦組織并在局部微環(huán)境中成熟［7］，通常位于血管周圍，與神經(jīng)元關(guān)系密切。肥大細(xì)胞不僅在免疫反應(yīng)中至關(guān)重要，而且也參與炎癥反應(yīng)［8］、自身免疫反應(yīng)［9，10］等，尤其在那些與情緒有關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用［11］。當(dāng)三叉神經(jīng)［12］、頸部［13］或 者蝶顎部 神 經(jīng)節(jié)［14］受到刺激后會(huì)激活硬腦膜上的肥大細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)肽類 物 質(zhì) ，如P物 質(zhì) （SP）［15］、垂 體 腺 苷 酸 環(huán) 化 酶 激 活 肽（PACAP）［16］、CGRP［15，17］、生 長 抑 素［18］、神 經(jīng) 加 壓 素（NT）［19］、甲狀旁腺激素［20］等，均可刺激肥大細(xì)胞脫顆粒并分泌炎癥介質(zhì)。腦膜痛覺感受器激活后這些神經(jīng)肽類可能由神經(jīng)周圍突分泌［21］。其他研究顯示［22］，精神壓力作為偏頭痛的誘發(fā)因素，通過由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）介導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制也可誘導(dǎo)硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒。肥大細(xì)胞脫顆?？梢苑置诙喾N與偏頭痛密切相關(guān)的介質(zhì)，如組胺、白三烯［23］、腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-6［24］、內(nèi)皮素-1［25］等。肥大細(xì)胞還分泌各種促炎介質(zhì)，比如激肽、前列腺素。大腦肥大細(xì)胞可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)血管的滲透性［26］。

伴有先兆的偏頭痛發(fā)作時(shí)，皮層擴(kuò)散抑制（CSD）致腦膜痛覺感受器激活，很可能通過神經(jīng)軸突反射促使硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒。而肥大細(xì)胞脫顆粒可以進(jìn)一步使腦膜痛覺感受器及偏頭痛痛覺通路維持激活狀態(tài)。肥大細(xì)胞分泌的多種因子中作為偏頭痛介質(zhì)激活腦膜痛覺感受器的可能有5-羥色胺（5-HT）、前列環(huán)素，另外還可能有組胺、類胰蛋白酶［27、28］，其中5-HT作用最為重要。5-HT主要通過其中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用參與偏頭痛的發(fā)病，但是其對(duì)腦膜痛覺感受器強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用提示很可能存在5-HT致偏頭痛的周圍機(jī)制［29］。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Brandon等改良后的甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)硬腦膜肥大細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示模型對(duì)照組大鼠硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率明顯高于其他各組，硝酸甘油致偏頭痛模型可以增加硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率，說明了NO具有誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒的作用，印證了偏頭痛發(fā)病過程中存在肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象，且主要位于硬腦膜上，它可能參與了NO所致的三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活過程。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差和避免精神壓力對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的影響，我們選擇了安靜屏障環(huán)境喂養(yǎng)大鼠及進(jìn)行各階段實(shí)驗(yàn)，單獨(dú)環(huán)境進(jìn)行單鼠實(shí)驗(yàn)操作，以減少對(duì)大鼠的各種刺激。

本實(shí)驗(yàn)觀察高、低劑量養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型的治療和預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)造模后30 min內(nèi)預(yù)防高、低劑量組偏頭痛大鼠硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率與模型對(duì)照組相比即有明顯降低，而預(yù)防高劑量組與預(yù)防低劑量組相比未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，提示預(yù)防性使用養(yǎng)血清腦顆?？赡茉谄^痛起始階段發(fā)揮抗偏頭痛作用，該作用可能與其在發(fā)作早期穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜減少脫顆粒有關(guān)，也說明其對(duì)偏頭痛的預(yù)防作用可能大于治療作用，與臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致［30］。針對(duì)各因素交互效應(yīng)的方差分析結(jié)果顯示，給藥順序（即治療性干預(yù)或者預(yù)防性干預(yù)）對(duì)行為學(xué)指標(biāo)及硬腦膜肥大細(xì)胞脫顆粒陽性率的影響較為明顯，而給藥劑量以及兩者的交互作用不顯著，目前還不能認(rèn)為預(yù)防性使用高劑量的養(yǎng)血清腦顆粒能夠產(chǎn)生更大的療效，仍需擴(kuò)大樣本量延長試驗(yàn)周期進(jìn)一步研究論證。

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