郭淑貞，啜文靜，付幫澤，王 勇，馮玄超，廉洪建，李長(zhǎng)虹，鄭 磊，王 偉

證候是疾病特定階段的病生理特征的綜合反映。除了宏觀四診信息，證候在微觀生物學(xué)指標(biāo)層面必然也存在著特征性的變化。證候特征性生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于提升臨床證候辨識(shí)的客觀性與準(zhǔn)確性。本文擬采用雙向電泳等蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，探討冠心病（心肌缺血）氣虛血瘀證特征性的血漿蛋白質(zhì)譜，并分析其與證候表征的相關(guān)性，為后續(xù)的證候生物學(xué)標(biāo)志物的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 采用課題組前期建立的方法，制備小型豬心肌缺血?dú)馓撗鲎C病證結(jié)合動(dòng)物模型［1］。中華小型豬（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)小型豬養(yǎng)殖基地，體重25 kg±4 kg，月齡6～10個(gè)月）左冠脈前降支近端放置Ameroid縮窄環(huán)制備心肌缺血模型。在模型動(dòng)物符合心肌缺血?dú)馓撗鲎C診斷的窗口（術(shù)后8周），采集舌象、心功能等指標(biāo)并采集血漿樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以同期的假手術(shù)動(dòng)物作為對(duì)照。每組6只。

1.2 舌r、g、b分析 數(shù)碼相機(jī)拍照記錄動(dòng)物舌象，以casmatch比色卡（BEAR Medic Corporation，日本）作為參照，采用photoshop軟件分析舌RGB值，并計(jì)算r、g、b。

1.3 左室射血分?jǐn)?shù)檢測(cè) 心動(dòng)超聲（惠普Agilent SONOS 5500，美國(guó)）Simpson法檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 血漿樣本收集和制備 動(dòng)物頸部前腔靜脈采血3 m L，采用枸櫞酸鈉抗凝，并加入蛋白酶抑制劑（Roche），4℃，3 500轉(zhuǎn)／分，離心25 min，收集上清，分裝后-80℃保存。

1.5 雙向凝膠電泳 樣品冰上解凍后，4℃、12 000 g，離心5 min，取上清。Bradford法測(cè)定血漿蛋白質(zhì)含量后，取1.3 mg上樣，補(bǔ)加重脹液至450μL。平衡后的膠條轉(zhuǎn)入提前制好的厚度為1.0 mm、13%的SDS-PAGE膠中，采用ETTAN Dalt Six電泳系統(tǒng)進(jìn)行第二向分離。確定膠條與二相膠面接觸良好，0.5%瓊脂糖封膠。凝膠通過UMAX 2100XL掃描，膠圖數(shù)據(jù)存儲(chǔ)后，采用Imagemaster 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測(cè)及匹配，配合三維圖像、Histogram及人工校對(duì)等方法，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的vol%的比值＞2或＜0.5作為可能的差異蛋白點(diǎn)，納入后續(xù)的分析。

1.6 差異蛋白斑點(diǎn)的鑒定 采用激光解吸附-時(shí)間飛行質(zhì)譜（Bruker Ultraflex質(zhì)譜儀，北京華大蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心檢測(cè)）進(jìn)行分析。質(zhì)譜獲得的單肽質(zhì)量通過檢索軟件Mascot在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選擇種屬為豬。搜索得到的結(jié)果如果在綠色陰影區(qū)域以外則表示結(jié)果基本可信。

2 結(jié) 果

2.1 血漿樣本雙向凝膠電泳 蛋白點(diǎn)的總體分布顯示了高度的相似性，共813個(gè)匹配的蛋白點(diǎn)群被納入分析。vol%＜0.5的蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，共確定了18種表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點(diǎn)（見表1）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的vol%的比值＞2的蛋白點(diǎn)被認(rèn)為表達(dá)上調(diào)，共確定了6種（見表2）。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 由于豬的蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于小鼠等模式生物，只有2個(gè)蛋白得到了陽(yáng)性檢索結(jié)果，分別為動(dòng)力蛋白重鏈6（Spot11）和視黃醇結(jié)合蛋白4（Spot17）。詳見表3。

2.3 左室射血分?jǐn)?shù)、舌象rgb與差異蛋白表達(dá)豐度的相關(guān)性（見表4、表5）

表1 心肌缺血?dú)馓撗鲎C表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點(diǎn)（±s ）

表1 心肌缺血?dú)馓撗鲎C表達(dá)下調(diào)的差異蛋白點(diǎn)（±s ）

編號(hào) 模型組 觀察組 模型組／對(duì)照組Spot1 0.150±0.107 0.955±0.409 0.157 Spot 2 0.011±0.004 0.055±0.021 0.205 Spot 3 0.140±0.037 0.523±0.125 0.267 Spot 4 0.011±0.002 0.035±0.008 0.304 Spot 5 0.012±0.008 0.039±0.013 0.308 Spot 6 0.124±0.036 0.337±0.081 0.367 Spot 7 0.006±0.004 0.015±0.013 0.368 Spot 8 0.194±0.005 0.483±0.387 0.401 Spot 9 0.882±0.009 2.141±0.997 0.412 Spot 10 0.211±0.018 0.509±0.133 0.414 Spot 11 0.010±0.001 0.024±0.010 0.419 Spot 12 0.142±0.019 0.321±0.046 0.443 Spot 13 0.188±0.109 0.414±0.212 0.453 Spot 14 0.703±0.340 1.540±0.906 0.456 Spot 15 0.453±0.158 0.958±0.554 0.473 Spot 16 0.476±0.110 0.995±0.260 0.478 Spot 17 0.021±0.005 0.043±0.012 0.481 Spot 18 0.026±0.008 0.052±0.024 0.488

表2 心肌缺血?dú)馓撗鲎C表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點(diǎn)（±s）

表2 心肌缺血?dú)馓撗鲎C表達(dá)上調(diào)的差異蛋白點(diǎn)（±s）

編號(hào) 模型組 對(duì)照組 模型組／對(duì)照組Spot 19 0.215±0.074 0.102±0.053 2.103 Spot 20 4.390±3.309 2.079±1.159 2.112 Spot 21 0.031±0.008 0.014±0.009 2.124 Spot 22 0.198±0.040 0.093±0.008 2.125 Spot 23 0.069±0.048 0.025±0.002 2.767 Spot 24 3.826±1.757 1.338±0.965 2.860 Spot 25 0.455±0.044 0.154±0.173 2.952

表3 部分差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表4 LVEF、舌rgb與蛋白表達(dá)豐度的相關(guān)性

表5 LVEF、舌rgb與差異蛋白表達(dá)豐度的線性回歸分析

3 討 論

本研究采用雙向凝膠電泳的方法分析了心肌缺血?dú)馓撗鲎C小型豬血漿蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)下調(diào)蛋白點(diǎn)和6個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)。這些差異蛋白點(diǎn)均有可能成為心肌缺血?dú)馓撗鲎C特征性的生物學(xué)標(biāo)志物，但必須通過多種檢測(cè)方法、大樣本的嚴(yán)格驗(yàn)證與分析。鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)屬于開放性研究系統(tǒng)，突破了既往從已知的疾病相關(guān)的文獻(xiàn)資料中篩選可能的證候生物學(xué)標(biāo)志物的局限，有可能發(fā)現(xiàn)新的、在相應(yīng)疾病的研究中尚無報(bào)道的證候特征性標(biāo)志物，這不僅有可能成為證候的診斷指征，而且有可能為證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究提示重要線索，還有望為疾病的發(fā)病機(jī)制闡明提示新的環(huán)節(jié)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果提示，在心肌缺血?dú)馓撗鲎C顯著下調(diào)的蛋白包括動(dòng)力蛋白重鏈6和視黃醇結(jié)合蛋白4。

基因本體論分類中，動(dòng)力蛋白最主要的生物進(jìn)程為ATP的分解代謝。動(dòng)力蛋白在體內(nèi)的作用主要包括具有ATP酶活性，可作為呼吸道纖毛運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來源、微管運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來源，并參與了神經(jīng)細(xì)胞的體積、心臟鉀通道［2］等的調(diào)控。動(dòng)力蛋白作為微管的重要組成部分還參與了心肌對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)性調(diào)控［3］。

視黃醇結(jié)合蛋白4主要參與視黃醛的結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)。在基因本體論分類中，視黃醇結(jié)合蛋白4的功能涉及多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程，其中主要包括心肌組織發(fā)育、心肌細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等。既往的研究多顯示視黃醇結(jié)合蛋白4與脂代謝［4］、頸動(dòng)脈粥樣硬化［5］、冠心病合并高胰島素血癥等相關(guān)［6］，血漿視黃醇結(jié)合蛋白4的水平在冠心病組并沒有升高［6］，而新近的女性人群研究則發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)的視黃醇結(jié)合蛋白4以及總視黃醇結(jié)合蛋白4呈時(shí)間依賴模式與冠心病的發(fā)病相關(guān)［7］。

目前的研究表明，動(dòng)力蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4均在能量代謝方面具有一定的作用，但并未見到上述蛋白與證候相關(guān)的研究報(bào)道。心肌缺血?dú)馓撗鲎C動(dòng)物外周血中動(dòng)力蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4下調(diào)可能與其心肌能量代謝降低有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。左室射血分?jǐn)?shù)反映了心功能的變化，也被作為心肌缺血?dú)馓撟C評(píng)價(jià)的主要指征之一［8］。本研究提示，左室射血分?jǐn)?shù)與差異蛋白Spot 22呈線性相關(guān)，差異蛋白Spot 22可能成為左室射血分?jǐn)?shù)用于氣虛證評(píng)價(jià)時(shí)的替代指征。

血瘀證診斷中，舌質(zhì)紫暗或舌體瘀斑、瘀點(diǎn)，舌下靜脈曲血是主要依據(jù)之一。本研究建立了rgb值定量分析小型豬舌色變化的方法［9］。本研究提示，Spot20、Spot 6、Spot 20分別與舌r、g、b值呈線性相關(guān)。盡管小型豬是心血管疾病最佳的動(dòng)物模型，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些與心肌缺血?dú)馓撗鲎C及其宏觀表征相關(guān)的血漿蛋白。但是關(guān)于小型豬的基因背景的研究遠(yuǎn)不及小鼠等模式生物完善，其基因、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的不完整，導(dǎo)致多數(shù)的差異蛋白未能獲得陽(yáng)性的鑒定結(jié)果，大大限制了其后續(xù)的研究與應(yīng)用。本研究后續(xù)還需要進(jìn)一步采用其他方法進(jìn)行多維度的分析與驗(yàn)證，上述候選的證候或宏觀表征特征性的血漿蛋白才可能真正應(yīng)用于臨床患者與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的證候辨識(shí)。

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