張學(xué)敏，馬風(fēng)杰，丁緒平，李 芳，趙玉嬌

腦出血（ICH）為原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，為中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其致殘率和死亡率均較高，給社會(huì)、家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其預(yù)后除了與出血量、出血部位有關(guān)外，也與血腫周?chē)t發(fā)性腦水腫引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周?chē)难装Y反應(yīng)參與局部水腫的形成［1，2］，因此從血腫周?chē)[帶形成機(jī)制的角度來(lái)治療腦出血備受關(guān)注。本研究通過(guò)地塞米松對(duì)大鼠腦出血血腫周?chē)M織白介素-8（IL-8）表達(dá)的影響，探討地塞米松對(duì)腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性Wister大鼠72只，體重250 g～350 g，購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與試劑 IL-8抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），二抗及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），地塞米松，10%水合氯醛，75%酒精，雙氧水，生理鹽水，多聚甲醛，5 m L注射器，立體定位儀（ZH-藍(lán)星 淮北正華設(shè)備有限公司）微量注射器，手術(shù)器械一套。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將72只大鼠隨機(jī)分為4組，每組18只，即假手術(shù)組、模型組、高劑量組、低劑量組，每組按取腦時(shí)間分為12 h、24 h、3 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。低劑量組從造模成功后至處死前每天腹腔注射地塞米松（0.5 mg／kg），高劑量組給予地塞米松（1.0 mg／kg），每日1次。模型組、假手術(shù)組均于相同時(shí)限腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.3.2 模型制備 采取自體血注入法制備大鼠腦出血模型。術(shù)前大鼠禁食12 h，不禁水。10%水合氯醛4 m L／kg腹腔麻醉，檢查睫毛反射減弱、捏耳無(wú)反應(yīng)時(shí)，將大鼠頭部固定立體定向儀，局部備皮，75%乙醇消毒局部皮膚，行頂部正中切口，以雙氧水腐蝕局部骨膜，暴露前囟，以前囟中央為中心原點(diǎn)，在原點(diǎn)后1.8 mm、右側(cè)4 mm，用5 m L注射器針頭鉆孔，用微量注射器插入顱骨表面下5 mm內(nèi)囊處緩慢注入50μL自體血（斷尾取血），留針5 min后緩慢將針退出，然后消毒局部加入青霉素粉并縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)模型制備完畢。模型組術(shù)后立即給予注射生理鹽水1.0 mL。高、低劑量組分別給予1.0 mg／kg、0.5 mg／kg地塞米松。

1.3.3 模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn) 大鼠清醒后，無(wú)神經(jīng)功能缺失、意識(shí)喪失、死亡的大鼠剔除，據(jù)Berderson等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為三級(jí)。Ⅰ級(jí)：將大鼠尾巴提起來(lái)，癱瘓側(cè)前肢回收后屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；Ⅱ級(jí)：除以上體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；Ⅲ級(jí)：除以上癥狀外，大鼠有向患側(cè)側(cè)旋的行為。出現(xiàn)以上癥狀為造模成功。

1.3.4 標(biāo)本收集與檢測(cè) 大鼠在出血后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)以10%水合氯醛腹腔麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，在心尖部剪開(kāi)一約2 mm小口，將穿刺針自切口插入心臟并送至主動(dòng)脈口處固定，37℃生理鹽水200 mL灌洗；然后以40 g／L多聚甲醛溶液500 m L灌注內(nèi)固定后斷頭取腦，將標(biāo)本置40 g／L多聚甲醛溶液中后固定約24 h，取血腫周?chē)X組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，制片后進(jìn)行HE染色觀察血腫周?chē)M織的炎癥反應(yīng)情況；免疫組化染色觀察IL-8的表達(dá)，IL-8免疫組化陽(yáng)性表達(dá)均為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈棕黃色。計(jì)數(shù)方法：每張切片取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算每高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)（方差不齊采用成組設(shè)計(jì)兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)）。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色 腦出血后血腫周?chē)忻黠@的炎癥細(xì)胞聚集，主要以單核巨噬細(xì)胞為主。

2.2 腦出血后血腫周?chē)M織IL-8表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 假手術(shù)組針道周?chē)猩倭縄L-8表達(dá)，但無(wú)明顯時(shí)間變化；模型組與治療組血腫周?chē)鶬L-8的表達(dá)在12 h升高，24 h達(dá)高峰，3 d開(kāi)始下降，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；主要在血管周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿及胞核內(nèi)表達(dá)。詳見(jiàn)表1。

2.3 地塞米松對(duì)大鼠腦出血后血腫周?chē)鶬L-8表達(dá)的影響治療組與模型組比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL-8的表達(dá)均下降（P＜0.05）；高劑量組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL-8的表達(dá)較低劑量組下降明顯（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組血腫周?chē)M織IL-8表達(dá)的比較±s） 個(gè)／視野

表1 各組血腫周?chē)M織IL-8表達(dá)的比較±s） 個(gè)／視野

組別12 h 24 h 3 d假手術(shù)組0.46±0.03 0.47±0.03 0.50±0.03模型組 0.52±0.03 7.20±0.31 5.32±0.37低劑量組 0.44±0.301） 5.84±0.141） 4.74±0.381）高劑量組 0.36±0.051）2） 3.55±0.261）2） 3.03±0.181）2）與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1）P＜0.05；與低劑量組比較，2）P＜0.05

3 討 論

腦出血是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的疾病，目前對(duì)腦出血尚無(wú)明確有效的治療方法。臨床上將甘露醇作為急性腦出血發(fā)病早期抗水腫的藥物，早在1989年WHO就報(bào)道急性腦出血應(yīng)用甘露醇易加重病情［3］，甘露醇在局部血腦屏障破壞后，可滲透至血管外腦組織間隙內(nèi)，從而使局部滲透壓升高，導(dǎo)致全身脫水而局部腦水腫反而加劇，形成所謂的“反跳現(xiàn)象”［4］，因此這類(lèi)藥物對(duì)于治療腦出血有其局限性。止血?jiǎng)?yīng)用的安全性和有效性也有待進(jìn)一步觀察，因此從血腫周?chē)[帶形成機(jī)制的角度來(lái)治療腦出血備受關(guān)注。目前大量實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，腦出血后血腫內(nèi)和血腫周?chē)嬖诿黠@的炎癥反應(yīng)，潘新發(fā)等［5］列舉了多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子，并詳細(xì)闡述了它們?cè)谄渲邪l(fā)揮的不同角色，最終導(dǎo)致局部腦組織血流的下降、周?chē)M織水腫的加重。

細(xì)胞因子是一類(lèi)具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，大部分是在細(xì)胞間發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)的作用，與機(jī)體免疫反應(yīng)、代謝、炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)關(guān)系密切。近年來(lái)的深入研究表明，細(xì)胞因子在腦出血后血腫周?chē)M織水腫的形成中有著重要的作用，其中IL-8就是一種在炎癥早期發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；其他如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等亦可在適宜的刺激條件下產(chǎn)生。IL-8可單獨(dú)或共同協(xié)同其他炎性因子通過(guò)介導(dǎo)或直接、間接參與炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮功能的異常［6］。王懷立等［7］通過(guò)應(yīng)用脂多糖建立的腦水腫動(dòng)物模型也證實(shí)IL-8參與腦組織含水量的增加和血腦屏障的破壞過(guò)程，是造成腦水腫發(fā)生的重要細(xì)胞因子之一。Yamasaki等［8］發(fā)現(xiàn)IL-8能促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集、細(xì)胞黏附和產(chǎn)生大量自由基并促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞因子的釋放失調(diào)，導(dǎo)致腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜損害，誘發(fā)血管源性水腫的發(fā)生和神經(jīng)元損傷。Mukaida等［9］報(bào)道應(yīng)用IL-8單克隆抗體或阻斷IL-8釋放可明顯減輕炎性反應(yīng)，阻止白細(xì)胞浸潤(rùn)，這些研究表明IL-8在腦出血中起著重要作用。

當(dāng)處于明顯的應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體可釋放大量糖皮質(zhì)激素，超生理劑量時(shí)有強(qiáng)大的抗炎作用。地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體的活性，減輕氧自由基對(duì)局部組織損傷的反應(yīng)，抑制磷脂酶，使炎性介質(zhì)、血管活性物質(zhì)生成減少，同時(shí)還可降低血腦屏障的通透性，增加局部大腦的血流量，改善缺血，從而減輕腦水腫，可以從炎癥反應(yīng)的角度治療腦出血［10］。本研究就是從腦出血后血腫周?chē)[帶形成機(jī)制的角度來(lái)治療腦出血，減輕局部腦水腫，改善腦出血預(yù)后，但對(duì)于地塞米松最終能否延長(zhǎng)大鼠生命及其產(chǎn)生的副反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

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