武建才，趙克斌，胡 敏

華法林是一種香豆素類口服抗凝藥，具有抗凝和溶栓的雙重作用。但由于華法林抗凝治療窗窄，抗凝不當(dāng)很容易導(dǎo)致出血或栓塞，甚至危及病人生命。因此，如何在臨床上合理有效使用華法林長(zhǎng)期以來(lái)一直是臨床醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)隨著藥物基因組學(xué)研究的不斷深入，大量研究表明，CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性是造成個(gè)體間華法林穩(wěn)定劑量差異的主要原因，故本研究旨在結(jié)合非遺傳因素探討山西地區(qū)漢族人群CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）基因型分布特點(diǎn)及對(duì)華法林日均維持劑量的影響，從而輔助臨床醫(yī)生指導(dǎo)患者個(gè)體化華法林的使用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2012年1月——2012年7月到山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院復(fù)查抗凝指標(biāo)的服用華法林抗凝患者179例（病例組），其中男84例，女95例，年齡（53.93±12.12）歲，體重指數(shù)（BMI）22.61 kg／m2±3.40 kg／m2。對(duì)照組為同期到我院門診健康體檢者150名，男72名，女78名，年齡（52.98±13.20）歲，所有入選對(duì)象均來(lái)自山西地區(qū)的漢族居民，相互間無(wú)血緣關(guān)系及異族通婚史。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲、穩(wěn)定抗凝超過(guò)1個(gè)月、國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)比值（INR）1.7～3.0［1］。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝腎及甲狀腺功能不全、營(yíng)養(yǎng)不良或懷孕者、服用可能與華法林有相互作用藥物（如胺碘酮、維生素K抑制劑等）的患者、有凝血功能障礙、華法林過(guò)敏者。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 在受試者知情同意的前提下，采集服藥后空腹12 h外周靜脈血3 m L（枸櫞酸鈉抗凝），用于檢測(cè)CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639 G＞A）基因型，全血標(biāo)本-20℃保存。同時(shí)采集患者的基本資料：年齡、性別、身高、體重、病因、伴隨藥物、使用華法林劑量及最近3次所測(cè)INR值等，計(jì)算BMI。INR值測(cè)定結(jié)果由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科生化室提供?；蚪MDNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自天根生化科技有限公司），將提取好的基因組DNA-20℃保存。

1.2.2 擴(kuò)增阻滯突變體系-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（ARMS-PCR）法擴(kuò)增 本研究所采用的ARMS-PCR引物和探針序列由北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，委托生物工程（上海）有限公司合成、純化。采用25μL ARMS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)液12.5μL，引物探針混合液6.5μL，超純水4μL，基因組DNA 2μL。反應(yīng)儀器：美國(guó)安捷倫 Mx3000熒光定量PCR儀。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性15 s，60℃退火延伸35 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，對(duì)患者和健康受試者的基因型頻率比較采用Fish精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入選患者基本特征（見(jiàn)表1）

表1 入選患者基本臨床特征

2.2 兩組基因型及等位基因頻率分布

2.2.1 CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率分布在入選的329例中，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA型293例（89.1%），AC型33例（10.0%），AC型3例（0.9%），說(shuō)明中國(guó)漢族人群中CYP2C9＊3（1075A＞C）以AA型為主。等位基因A和C的頻率分別為94.1%和5.9%，說(shuō)明在中國(guó)漢族人群中以等位基因A為主。兩組間CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可認(rèn)為正常人和患者之間SNP分布無(wú)差異。詳見(jiàn)表2。

表2 CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率比較 例（%）

2.2.2 VKORC1（-1639 G＞A）基因型及基因頻率分布 在入選的329例中，VKORC1（-1639 G＞A）AA型278例（84.5%），GA型51例（15.5%），未發(fā)現(xiàn)GG型，說(shuō)明在中國(guó)漢族人群中VKORC1（-1639 G＞A）基因以AA型分布為主。A和G的等位基因頻率分別為92.3%和7.7%，說(shuō)明在中國(guó)漢族人群中以等位基因A為主。兩組間VKORCL（-1639G＞A）基因及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可認(rèn)為正常人和患者之間SNP分布無(wú)差異。詳見(jiàn)表3。

表3 VKORC1（-1639 G＞A）基因型及等位基因頻率比較 例（%）

2.3 年齡、性別、體重指數(shù)及基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系 由于本研究中華法林日均穩(wěn)定劑量不符合正態(tài)分布，所以對(duì)CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1（-1639G＞A）和性別采用非參數(shù)檢驗(yàn)，其Mann-Whitney U統(tǒng)計(jì)量分別為121 5，P＜0.05；882.5，P＜0.05；3 401.5，P＞0.05。因此可以認(rèn)為CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同性別間華法林穩(wěn)定劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將年齡和體重指數(shù)與華法林穩(wěn)定劑量做相關(guān)性分析顯示，年齡與華法林穩(wěn)定劑量呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.186，P＜0.05），體重指數(shù)與華法林穩(wěn)定劑量無(wú)明顯相關(guān)（r＝-0.007，P＞0.05）。

因?yàn)镃YP2C9＊3（1075A＞C）CC型發(fā)現(xiàn)例數(shù)只有2例，為便于分析將其與AC型合并成一組，分析發(fā)現(xiàn)：CYP2C9＊3（1075A＞C）（AC＋CC）型華法林日均穩(wěn)定劑量（2.35±1.13）mg／d明顯低于 AA型（2.92±1.11）mg／d（P＜0.05），兩組間年齡、性別、體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VKORC1（-1639G＞A）AA型華法林穩(wěn)定劑量（2.72±1.00）mg／d明顯低于GA型（3.84±1.46）mg／d（P＜0.05），兩組間年齡、性別、體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同基因型間華法林穩(wěn)定劑量比較詳見(jiàn)表4。

表4 不同基因型患者華法林日均穩(wěn)定劑量比較

3 討 論

華法林作為一線口服抗凝藥，目前在臨床上仍被廣泛使用，研究表明，不同患者使用華法林的劑量可以相差20倍［2］，造成華法林維持劑量差異的原因包括遺傳因素和非遺傳因素，近年來(lái)研究表明，VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性是影響華法林劑量個(gè)體差異的主要遺傳因素，這兩個(gè)基因可解釋40%左右華法林的個(gè)體劑量差異［3］。故本研究結(jié)合非遺傳因素（年齡、性別、BMI）探討了山西地區(qū)漢族人群CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）基因多態(tài)性分布特點(diǎn)及對(duì)華法林穩(wěn)定劑量的影響。

INR的目標(biāo)值將直接決定著患者所需華法林的劑量，因我國(guó)采用INR監(jiān)測(cè)抗凝效果比較晚，目前在華法林的抗凝強(qiáng)度、抗凝監(jiān)測(cè)方面還不完善［4］，本研究在綜合相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上將納入患者的目標(biāo)INR值定為1.7～3.0，且所有入選患者在服用華法林的過(guò)程中均未發(fā)生栓塞或出血等不良事件［5］。

本研究采用ARMS-PCR法對(duì)150名健康人群和179例服用華法林患者基因型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常人和患者之間CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）的SNP分布無(wú)差異，與李勝軍等［6］在江蘇地區(qū)的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，CYP2C9＊3（1075A＞C）基因及等位基因頻率分布，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道基本一致，可以認(rèn)為CYP2C9＊3（1075A＞C）基因及等位基因分布無(wú)明顯的人種差異［7］。VKORC1（-1639G＞A）基因及等位基因頻率分布與國(guó)內(nèi)馬心超等［8］報(bào)道結(jié)果基本一致，而與國(guó)外 Geiser等［9］報(bào)道的結(jié)果相反，可見(jiàn)在不同種族間VKORC1（-1639 G＞A）基因型分布存在人種差異，亞洲人群中AA型居多，而在白種人中GG型居多。

另外，本研究中入選的179例患者所服用的華法林穩(wěn)定劑量從0.75 mg／d到7.4 mg／d不等，個(gè)體間劑量差異可達(dá)十余倍，進(jìn)一步提示華法林穩(wěn)定劑量個(gè)體差異較大。CYP2C9＊3（1075A＞C）（AC＋CC）型華法林日均穩(wěn)定劑量較AA型降低了19.5%，VKORC1（-1639G＞A）AA型華法林穩(wěn)定劑量較GA型降低了26.9%，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［10］，進(jìn)一步提示CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）的基因變異會(huì)導(dǎo)致個(gè)體間華法林穩(wěn)定劑量的差異，而且進(jìn)一步證明了VKORC1基因的變異造成個(gè)體間華法林穩(wěn)定劑量差異的作用更大［11］。

在影響華法林維持劑量的非遺傳因素中研究發(fā)現(xiàn)年齡與華法林日均穩(wěn)定劑量呈負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［12］，其原因可能為隨著年齡的增長(zhǎng)，個(gè)體的肝腎功能及代謝能力降低，合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ能力減退，肝細(xì)胞色素P450酶含量及活性逐步下降，血漿蛋白結(jié)合率及華法林代謝清除率有所降低，從而導(dǎo)致了高齡患者所需華法林劑量的減少。性別和體重指數(shù)與華法林日均穩(wěn)定劑量無(wú)明顯相關(guān)，其原因可能是由于本研究所選樣本量較小或所選樣本單一有關(guān)，所以今后的研究需要加大樣本量并拓寬入選人群進(jìn)行研究。

綜上所述，年齡以及CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族人群華法林穩(wěn)定劑量具有顯著的影響，臨床醫(yī)生在用藥之前參考這些變量可以指導(dǎo)患者個(gè)體化華法林的使用，對(duì)臨床提高華法林的安全使用具有潛在的價(jià)值。

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