董靜梅，陳佩杰

（1.同濟(jì)大學(xué)體育教學(xué)部 上海200092；2.上海體育學(xué)院 上海200438）

過度訓(xùn)練（overtraining，OT）引起的運(yùn)動(dòng)性免疫抑制與過氧化損傷是影響運(yùn)動(dòng)員身體健康，困擾運(yùn)動(dòng)員提高運(yùn)動(dòng)水平的難點(diǎn)問題，谷氨酰胺（glu-tamine，Gln）作為細(xì)胞能量代謝的底物，可有效提高運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力［1］。但一個(gè)不容忽視的問題是：運(yùn)動(dòng)本身可引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，而運(yùn)動(dòng)時(shí)Gln的補(bǔ)充在給予細(xì)胞能量的同時(shí)，又增加了體內(nèi)組織細(xì)胞內(nèi)源一氧化氮（nitric oxide，NO）的大量產(chǎn)生，這樣活性氧、活性氮的雙重因素可引起細(xì)胞的氧化損傷而導(dǎo)致細(xì)胞功能水平的下降［2］，前期的研究證明：運(yùn)動(dòng)時(shí)NADPH氧化酶是運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞非特異免疫功能變化的調(diào)控靶點(diǎn)［3］。基于此，本研究首次采用NADPH氧化酶抑制劑DPI與Gln補(bǔ)充作為合并干預(yù)的手段，分析探討過度訓(xùn)練及其單純補(bǔ)充Gln與合并干預(yù)對(duì)機(jī)體氧化水平的影響及機(jī)制，以達(dá)到逆轉(zhuǎn)過度訓(xùn)練引起的中性粒細(xì)胞過氧化損傷，為防護(hù)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的方法學(xué)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

四甲基乙二胺（TEMED），二硫蘇糖醇（DTT），甘氨酸（G）購自美國(guó)Promega公司；蛋白Marker由中科院上海生物化學(xué)研究所監(jiān)制；苯磺酸（BSA）十二烷基硫酸鈉（SDS）三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購自上海迪奧生物科技有限公司。谷氨酰胺（Gln）購自美國(guó)Sigma公司。一抗gp91phoxrabbit polyclonal IgG和P47phoxGoat polyclonal IgG及二抗rabbit polyclonal to Goat IgG-HRP、Goat polyclonal to Rabbit均購自美國(guó)Santa cruz公司；本實(shí)驗(yàn)所有血液指標(biāo)試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；呼吸爆發(fā)和吞噬功能檢測(cè)試劑盒購自德國(guó)Glycotope Biotechnology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

50只雄性 Wistar大鼠（體重 225±6.7g），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后（環(huán)境溫度20℃～25℃，每天光照時(shí)間保證12 h，自由飲食水）。隨機(jī)取8只作為安靜對(duì)照組（C），其余繼續(xù)進(jìn)行4周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練后，隨機(jī)分為4個(gè)組（n＝8）：?jiǎn)渭冞^度訓(xùn)練組（E）、過度訓(xùn)練 DPI干預(yù)組（D）、過度訓(xùn)練谷氨酰胺干預(yù)組（G）、過度訓(xùn)練與DPI合并谷氨酰胺干預(yù)組（DG）。

1.3 訓(xùn)練模型

整個(gè)訓(xùn)練模型在參照巴西Hohl的方法［4］的基礎(chǔ)上，在最后一周的訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)至大鼠力竭，力竭的標(biāo)準(zhǔn)以大鼠四肢無力支持住身體、頭部低垂、電刺激后不能繼續(xù)正常奔跑為力竭標(biāo)準(zhǔn)，成功建模的標(biāo)準(zhǔn)以同安靜組比較，單純過度訓(xùn)練組大鼠血漿皮質(zhì)醇和睪酮在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著降低為據(jù)。

1.4 給藥時(shí)間及劑量

從第5周開始，D組在訓(xùn)練前半小時(shí)腹腔注射DPI（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)：D2926），給予濃度與方法參考［5］，G組參考金其貫的方法給予L-谷氨酰胺（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)：G-3126）進(jìn)行干預(yù)［6］，DG組按相同劑量與方法給予DPI與谷氨酰胺，同時(shí)E組給予與D、G組相同方法相同劑量的安慰劑（即DPI與Glu的稀釋液分別為5%葡萄糖注射液和0.9%生理鹽水（上海醫(yī)藥產(chǎn)））。

1.5 血樣收集

過度訓(xùn)練指標(biāo)的血樣采取：在第十一周大鼠訓(xùn)練的最后兩天的次日早晨用毛細(xì)管取C組、E組大鼠眼眶靜脈叢血0.2 ml（EDTA抗凝），立即分離血漿用于皮質(zhì)醇（cortisol，T）和睪酮（corticosterone，Cort）的檢測(cè)。

過度訓(xùn)練后采血：為避免運(yùn)動(dòng)應(yīng)激和麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，這次采血所有大鼠均保證在末次訓(xùn)練的36～40 h內(nèi)眼眶靜脈叢取血3 ml血液分裝在EDTA抗凝管（0.5 ml，標(biāo)記為A管）和肝素抗凝管（2.5 ml，標(biāo)記為 B管）后立即斷頭處死。

1.6 中性粒細(xì)胞的分離與凍存

按多型核細(xì)胞分離液說明書取分離液1 ml與離心管中，將等比的1 ml血液小心鋪與分離液液面上后離心（450 g，35 min，18～22℃），分別用吸管吸取取中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分離層后用0.45%NaCI低滲液洗兩次，用PBS洗一次后加入0.4%胎盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107cells／ml，使制備好的活細(xì)胞數(shù)不低于96%后懸浮于預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液后分取 500μl離心（2 500 r／min、5 min、4℃），棄上清，收集中性粒細(xì)胞凍存在-80℃以備測(cè)定蛋白濃度及Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.7 血漿指標(biāo)的測(cè)定

中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）、白介素-1β（interleukin，IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒細(xì)胞集落刺激因子 （granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（MDA）以及皮質(zhì)醇，睪酮等指標(biāo)的測(cè)定按酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA KIT）測(cè)定步驟進(jìn)行。

1.8 NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox與 p47phox的蛋白印跡的測(cè)定

取出凍存的中性粒細(xì)胞，在凍融后分別加入PBS溶液1 ml，將樣品稀釋至已測(cè)定的總蛋白含量，取200μl樣品加入50μl 5×SDS上樣 buffer，95℃處理10 min后電泳。電泳約40 min后等到溴酚藍(lán)跑出分離膠即可停止電泳，用buffer平衡10 min后按規(guī)定的順序依次放好膠、膜及濾紙進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后加入 anti-gp91phox、anti-p47phox（一抗）過夜，洗脫，再分別加入二抗搖床孵育1 h后，DAB顯色液顯色，TANON GIS-2008凝膠成像儀灰度掃描，GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定目標(biāo)條帶面積和灰度值，通過目標(biāo)蛋白與內(nèi)參對(duì)比進(jìn)行半定量分析，目標(biāo)蛋白含量＝條帶面積×平均灰度，蛋白半定量值＝目標(biāo)蛋白含量／β-actin蛋白含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有測(cè)試結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用SPSS 11.5軟件分析處理，進(jìn)行單因素方差分析的LSD對(duì)比分析；Pearson相關(guān)分析用于NADPH氧化酶活性與MPO、MDA的相關(guān)性分析；Stepwise法對(duì)中性粒細(xì)胞功能變化、NO生成與NADPH氧化酶活性之間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 過度訓(xùn)練后DPI合并Gln補(bǔ)充后血漿細(xì)胞因子的變化

同安靜對(duì)照組比較，過度訓(xùn)練后E組血漿各細(xì)胞因子濃度均顯著性上升，其中 IL-1β、IL-6、CINC、GCSF達(dá)到非常顯著性水平；DPI干預(yù)組（D）除 IL-1β顯著下降（P＜0.01，表 1）。Gln補(bǔ)充組（G）中除 NO顯著上升外，其余細(xì)胞因子的變化基本同過度訓(xùn)練組（E）。而DPI合并 Gln補(bǔ)充組（DG）中只有 NO和CINC顯著增加，其余各組的細(xì)胞因子濃度無顯著變化。過度訓(xùn)練組、Gln補(bǔ)充組（G）中血漿 IL-1β、IL-6、TNF-α等這些炎性因子及G-CSF的表達(dá)增加，說明過度訓(xùn)練可引起細(xì)胞炎性因子的分泌及中性粒細(xì)胞大量的募集而誘發(fā)炎癥的發(fā)生，DPI具有顯效的抑制這些炎癥因子的增加作用，同時(shí)Gln補(bǔ)充組（G）和DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）中血漿NO的水平均顯著增加，其中G組具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)意義。

Tab.1 Concentration of cytokine in plasma after overtraining（ˉx±s，n＝8）

2.2 DPI合并Gln補(bǔ)充大鼠過度訓(xùn)練后血漿過氧化水平的變化

通過實(shí)施DPI干預(yù)合并Gln補(bǔ)充，大鼠過度訓(xùn)練后血漿MDA（圖1）同安靜對(duì)照組相比，過度訓(xùn)練組（P＜0.01）及 Gln補(bǔ)充組（G）顯著上升（P＜0.05），DPI干預(yù)組（P＜0.05）及 DPI合并 Gln補(bǔ)充組（DG）（P＜0.01）則顯著低于過度訓(xùn)練組。

2.3 DPI合并Gln補(bǔ)充大鼠過度訓(xùn)練后血漿MPO及NADPH氧化酶活性的變化

圖2所示的大鼠過度訓(xùn)練后各組血漿MPO的水平（圖2A）及NADPH氧化酶（圖2B）兩指標(biāo)的變化基本相同，同安靜組比較，過度訓(xùn)練組（E）與Gln補(bǔ)充組（G）的中性粒細(xì)胞活性均升高（P＜0.05），而DPI干預(yù)組及DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）顯著低于過度訓(xùn)練組（P＜0.01），說明DPI能有效抑制中性粒細(xì)胞的激活和NADPH氧化酶，而DPI合并Gln補(bǔ)充組對(duì)中性粒細(xì)胞激活和NADPH氧化酶的抑制效果更為顯著。

Fig.1 Concentration of MDA in rat plasma after overtraining C：Control group；E：Overtraining group；D：Administration group；G：Glutamine supplementation group；DG：Combined DPI and glutamine group；MDA：Malondialdehyde

2.4 DPI干預(yù)合并Gln補(bǔ)充大鼠過度訓(xùn)練后離體外周血中性粒呼吸爆發(fā)和吞噬功能的變化

過度訓(xùn)練后各組中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的氧化細(xì)胞百分比與平均熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3A）：同安靜對(duì)照組比較，大鼠中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的氧化細(xì)胞百分比與平均熒光強(qiáng)度同步在單純過度訓(xùn)練組（E）顯著降低（P＜0.05），DPI干預(yù)組（D）與 Gln補(bǔ)充組（G）兩者也有降低但未達(dá)到顯著性水平。但各組同過度訓(xùn)練組（E）相比，DPI干預(yù)組（D）、Gln補(bǔ)充組（G）及其 DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）的呼吸爆發(fā)氧化細(xì)胞百分比與平均熒光強(qiáng)度則有同步上調(diào)的趨勢(shì)，并且DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的上調(diào)達(dá)到顯著性水平（P＜0.05）。

Fig.2 Concentration of MPO and the activity of NADPH-oxidase after overtraining

Fig.3 Changes of the neutrophils function after overtraining in five groups

而過度訓(xùn)練后各組中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)結(jié)果與呼吸爆發(fā)功能完全不同的是（圖3B）：同安靜對(duì)照組（C）相比，過度訓(xùn)練組（E）的吞噬功能顯著降低達(dá)到非常顯著性水平，但DPI干預(yù)組（D）、Gln補(bǔ)充組（G）及其DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）的吞噬功能則無顯著變化，但與過度訓(xùn)練（E）組比較，DPI干預(yù)組（D）、Gln補(bǔ)充組（G）及其 DPI合并 Gln補(bǔ)充組（DG）三組的吞噬功能則有程度不一的升高，其中DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）的升高達(dá)到非常顯著性水平（P＜0.01）。此結(jié)果說明過度訓(xùn)練可引起中性粒細(xì)胞吞噬功能的顯著下降，而單純DPI和Gln有逆轉(zhuǎn)其功能下降的趨勢(shì)，但DPI和Gln的合并干預(yù)能更有效的逆轉(zhuǎn)。

2.5 過度訓(xùn)練后DPI干預(yù)合并Gln補(bǔ)充大鼠中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達(dá)

過度訓(xùn)練后利用Western blot方法測(cè)定各組大鼠中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和p47phox蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示：同安靜組（C）比較，過度訓(xùn)練組（E）中大鼠中性粒細(xì)胞 NADPH氧化酶gp91phox和 p47phox的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01），而除了DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）的 gp91phox的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）外，其余各組的 gp91phox和p47phox蛋白表達(dá)均無顯著性變化；但同過度訓(xùn)練組（E）比較 DPI干預(yù)組（D）、Gln補(bǔ)充組（G）及 DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG），無論是 gp91phox還是 p47phox的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，甚至在DPI合并Gln補(bǔ)充組（DG）的gp91phox的蛋白表達(dá)下調(diào)達(dá)到了非常顯著性水平（圖4）。這說明過度訓(xùn)練可引起中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達(dá)上調(diào)，而單純的DPI干預(yù)和Gln的補(bǔ)充可抑制這種上調(diào)的趨勢(shì)，兩種合并干預(yù)可有效的抑制這種由于過度訓(xùn)練引起的NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox蛋白表達(dá)的上調(diào)。

Fig.4 Expression of gp91phox and p47phox of NADPH-oxidase in neutrophils induced by overtraining

3 討論

3.1 過度訓(xùn)練對(duì)中性粒細(xì)胞功能的影響

過度訓(xùn)練作為一種刺激可誘發(fā)一系列的生理及免疫功能的綜合反應(yīng)進(jìn)而影響到運(yùn)動(dòng)員正常運(yùn)動(dòng)技能的發(fā)揮。本研究前期［7］對(duì)過度訓(xùn)練后中性粒細(xì)胞的凋亡，淋巴細(xì)胞的DNA損傷以及中性粒細(xì)胞體外呼吸爆發(fā)與吞噬功能進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)：過度訓(xùn)練激活NADPH氧化酶而使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和氧化應(yīng)激［7］。而本實(shí)驗(yàn)的研究揭示：過度訓(xùn)練可引起外周血漿炎性因子、趨化分子分泌增加，中性粒細(xì)胞募集及外滲相關(guān)的黏附蛋白的表達(dá)上調(diào)等可誘發(fā)周圍組織炎癥的發(fā)生；同時(shí)過度訓(xùn)練后NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，根據(jù)這兩種蛋白移位至質(zhì)膜上的共定位分子遷移理論［8］證明：過度訓(xùn)練激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶而引起呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS。而這些炎性因子及ROS的產(chǎn)生又可反饋性的激活NADPHA氧化酶引發(fā)中性粒細(xì)胞的過度激活，產(chǎn)生過多的ROS，因而引起中性粒細(xì)胞的凋亡甚至壞死從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)和吞噬功能的降低。

3.2 中性粒細(xì)胞的谷氨酰胺代謝及補(bǔ)充對(duì)中性粒細(xì)胞功能的影響

谷氨酰胺在細(xì)胞能量代謝中的作用早已被大家所認(rèn)同，大量的體外孵育處理和在體實(shí)驗(yàn)均提示谷氨酰胺在調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和中性粒細(xì)胞遷移中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充谷氨酰胺有提升中性粒呼吸爆發(fā)和吞噬功能改變的趨勢(shì)；而補(bǔ)充谷氨酰胺組NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和 p47phox的蛋白表達(dá)未有變化可以斷定谷氨酰胺的補(bǔ)充對(duì)激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶無顯著的作用，但可有效逆轉(zhuǎn)由于過度運(yùn)動(dòng)引起的中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能。

但較為矛盾的是過度訓(xùn)練狀態(tài)下線粒體活性氧生成增多［9］，血液中 IL-6、G-CSF的濃度增加，血漿過氧化水平的增加、MPO及NADPH氧化酶活性的增加，而補(bǔ)充谷氨酰胺在理論上本身可以引起ROS產(chǎn)生增加，這豈不引起谷氨酰胺與過度訓(xùn)練疊加的ROS生成增多而導(dǎo)致機(jī)體過氧化損傷增加嗎？我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)充谷氨酰胺后并不能有效的緩減過度訓(xùn)練引起的血漿中炎性因子的增加，如IL-6、CINC、G-CSF，卻可以明顯提升由于過度訓(xùn)練引起的NO的減少，但血漿過氧化水平、MPO及NADPH氧化酶的活性同過度訓(xùn)練組比較有下降的趨勢(shì)。

3.3 中性粒細(xì)胞中 iNOS介導(dǎo)產(chǎn)生的 NO與NADPH氧化酶的消長(zhǎng)性關(guān)系

NO是L-精氨酸和氧分子在誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）的作用下利用NADPH提供的電子而合成的。補(bǔ)充NO的供體Gln可減少中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附而加速其在血管中的移行，同時(shí)由于中性粒細(xì)胞NO代謝中谷氨酰胺作為氮的供體可增加內(nèi)源性NO的生成而調(diào)控內(nèi)皮功能信號(hào)分子的作用。但由于NO共用NADPH提供電子，NADPH氧化酶與NO之間有相互抵御的消長(zhǎng)作用，也就是說中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶活性增加會(huì)抑制iNOS的活性而減少NO的產(chǎn)生，而NO的過度產(chǎn)生又可抑制機(jī)體中NADPH氧化酶活性而減少此途徑產(chǎn)生的ROS，這兩種因素相互抵消的矛盾在最近的 Chen（2010）糖尿病研究報(bào)道中也有體現(xiàn)［10］。據(jù)此推測(cè)過度訓(xùn)練時(shí)補(bǔ)充Gln在增加NO生成的同時(shí)抑制了NADPH氧化酶的活性，從而減少由NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的ROS，而單純補(bǔ)充Gln過度訓(xùn)練后ROS的生成主要是iNOS介導(dǎo)生成的過量的NO所致。因此運(yùn)動(dòng)時(shí)單純補(bǔ)充Gln可引起NO的大量生成而出現(xiàn)新的自由基損傷。

3.4 DPI合并Gln補(bǔ)充對(duì)過度訓(xùn)練引起的中性粒細(xì)胞功能下降的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制分析

本研究對(duì)大鼠中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox和p47phox的蛋白表達(dá)的檢測(cè)表明：DPI合并Gln可適度有效抑制NADPH氧化酶的活性而產(chǎn)生適度的ROS，而過度訓(xùn)練后而與之有消長(zhǎng)關(guān)系的血漿NO濃度卻顯著增加，因此我們有理由推測(cè)DPI合并Gln補(bǔ)充可能一方面從活性氧產(chǎn)生途徑上抑制中性粒細(xì)胞NADPH介導(dǎo)產(chǎn)生過多的ROS，另一方面從Gln固有的對(duì)細(xì)胞補(bǔ)充能量的角度出發(fā)來實(shí)施對(duì)細(xì)胞免疫的調(diào)理作用，而且由于NO與NADPH氧化酶的消長(zhǎng)性關(guān)系，過度訓(xùn)練引起的內(nèi)源性NO的增多也可反饋性降低NADPH氧化酶使兩者達(dá)到某種平衡。因此DPI合并Gln補(bǔ)充針對(duì)過度訓(xùn)練引起的血液過氧化水平、中性粒細(xì)胞的過度激活，中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的降低具有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。

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