羅鴻斌

(東莞理工學院 科研處，廣東東莞 523808)

近年來，環(huán)境污染愈演愈烈，已嚴重影響人們的日常生活和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。如何在經(jīng)濟高速發(fā)展的同時，有效地治理環(huán)境，實現(xiàn)生態(tài)文明，以達到和諧社會之目標是急需解決的問題。隨著生物技術的迅速發(fā)展，尤其是以現(xiàn)代分子生物學技術為代表的生物技術，由于其快速、靈敏、特異性高等特點，在環(huán)保領域得到了廣泛的應用。本文主要綜述聚合酶鏈式反應技術、環(huán)介導等溫擴增法、核酸分子雜交技術、酶聯(lián)免疫吸附技術、生物芯片技術、生物傳感器等6 種現(xiàn)代分子生物學技術的原理和在環(huán)境監(jiān)測中的應用。

1 聚合酶鏈式反應技術(PCR)

1.1 概念及特點

PCR 技術是現(xiàn)代分子生物學的基礎實驗工具，在生物學研究領域已應用成熟，并衍生出諸多不同種類，如逆轉(zhuǎn)錄PCR、定量PCR、多重PCR、競爭PCR、巢式PCR、嵌套PCR 等。PCR 是DNA 的一種體外擴增技術，在一定的反應條件下，根據(jù)堿基互補配對的原理，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA 得以迅速擴增，并通過凝膠電泳、熒光等技術手段顯現(xiàn)擴增結果。PCR 方法具有快速、操作簡便、特異性強、靈敏度高等特點，可以對環(huán)境的各個方面進行監(jiān)測。

1.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

PCR 技術適用于檢測不能培養(yǎng)的微生物，已逐漸取代了傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，用于土壤、水樣、沉積物等環(huán)境標本的檢測，極大提高監(jiān)測效率。在實際檢測中，不同的微生物病原體具有不同的致病劑量，確定環(huán)境樣品中病原體的數(shù)量和種類，提高檢測的準確度至關重要。有研究表明，飲用水樣品中只有不到1%的微生物可經(jīng)實驗室培養(yǎng)［1］。PCR 技術由于靈敏度高，可在濃度很小的情況下檢出病原體，而且比電鏡更加靈敏、簡便、特異性更高，可以針對某種或某幾種致病微生物作出檢測判斷，在水環(huán)境微生物檢測中得到廣泛應用。在大氣監(jiān)測方面，Thomson 用PCR 檢測暴露在過量O3和固體顆粒物的空氣環(huán)境中4 h 的人體腦垂體基因表達情況，從而間接評估空氣質(zhì)量［2］;陳維田等應用PCR 方法對空調(diào)冷卻塔水與空氣軍團菌進行檢測的時間僅需6 小時到1 個工作日［3］。

PCR 技術與變性梯度電泳技術(DGGE)的結合，可分離長度相同但是序列不同的DNA 片斷混合物。陳竹等闡述了PCR－DGGE 技術在造紙廢水中微生物檢測的應用［4］;楊慶宇等使用PCR－DGGE技術來分析生物塔(廢氣從上面進入)中的微生物多樣性，可以反映真實的環(huán)境情況。而傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)大約只能得到環(huán)境中1%的微生物，且微生物經(jīng)過培養(yǎng)后會發(fā)生變異，不能反映環(huán)境中的真實情況［5］。

這幾年的研究熱點，熒光定量PCR(FQ－PCR)是通過在PCR 體系中加入熒光基因，利用熒光信號的變化來實時檢測反應過程，從而實現(xiàn)定量的PCR 檢測。Brooks 等證明該技術對雨季時海水中的甲肝病毒的檢測及定量測定均有很高的精確度。同時指出該技術對于環(huán)境微生物定量測定的發(fā)展前景［6］。Rebecca 等對容易引起水傳播疾病的賈第蟲和隱孢子蟲建立了定量分析方法［7］。Frich 等證明實時PCR監(jiān)測水體中嗜肺軍團桿菌的結果與傳統(tǒng)標準方法一致，但它的檢測靈敏性和重現(xiàn)性均比傳統(tǒng)方法高［8］。隨著該技術的不斷成熟，以及和其它分子生物學技術配合使用，必將有廣闊的應用前景。

2 環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)

2.1 概念及特點

LAMP 是近年較為流行的分子生物學技術，與以前的PCR 相關技術的設計思路不同，此方法是針對靶序列中6 個基因區(qū)段設計2 對特殊引物，利用Bst DNApolymerase 在延伸DNA 同時的鏈置換活性，通過引物獨特的反轉(zhuǎn)設計，對目的片段進行鏈置換擴增，整個反應在恒溫條件(61℃～65 ℃左右)下幾十分鐘即可完成DNA 擴增。也可以直接以RNA 為模板擴增，加入AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，一步實現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄和擴增，不需要合成cDNA。由于擴增反應的效率很高，擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度可直觀察判斷。日本榮研公司已利用這種特性研制出濁度儀用于實時監(jiān)測LAMP 反應。在終產(chǎn)物中加入熒光染料，直接用肉眼觀察比色。LAMP 方法靈敏度高，反應效率高，特異性強，結果易判定、操作簡便，設備簡單、成本低，適合基層的簡易環(huán)境監(jiān)測實驗室使用。

2.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

可通過榮研公司建立的官方網(wǎng)站了解和利用LAMP 擴增的原理、引物設計、LAMP 的研究進展。國內(nèi)眾多研究人員已建立起病原微生物的LAMP 檢測方法，在環(huán)境監(jiān)測領域的應用也將越來越多。楊麗建立了快速高效檢測水環(huán)境三種典型腸病毒(星狀病毒、輪狀病毒、諾如病毒)的LAMP 檢測方法，通過實驗條件的優(yōu)化驗證該方法的特異性和靈敏度，并應用于部分實際水樣的檢測，對于改進污水處理工藝有重要作用［9］。有土耳其學者使用顯微技術、巢式PCR、LAMP 三種技術，對黑海旁Ordu 省的70 份水樣的隱孢子蟲進行檢測，表明LAMP 檢測效率更高［10］。

3 核酸分子雜交技術

3.1 概念及特點

核酸分子雜交技術的基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫室度及離子強度等)可按堿基互補配對成雙鏈，用特異性的探針與待測樣品的DNA 或RNA 形成雜交分子的過程。核酸分子雜交技術主要有以下幾種:Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、芯片雜交。核酸雜交技術具有其高度特異性、靈敏性、快速等特點。

3.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

核酸分子雜交技可以快速檢測出環(huán)境微生物中獨特的核酸序列。如對活性污泥中的特定微生物的生長速率進行測定，根據(jù)放射性強度可以定量分析特定細菌的DNA 量。在對被石油污染的土壤分析中，用核酸雜交法得到某種烴降解基因的檢出率顯著高于不污染樣品，結果表明，污染越嚴重，這種降解基因的含量也越高，可用來評價中石油污染程度［11］。

熒光原位雜交技術(FISH)是核酸原位雜交技術中應用最為廣泛的技術之一。該技術結合了分子生物學的精確性和顯微鏡的可視性，無需單獨分離出DNA 或RNA，通過激發(fā)雜交探針的熒光來檢測信號從而對未知的核酸序列進行檢測，結果可直接在熒光顯微鏡下觀察。Gulnur Coskuner 認為FISH 技術能揭示更多硝化細菌的微生物學方面的信息及它們種群的大小，更有利于改進生物脫氮系統(tǒng)的工藝，避免了傳統(tǒng)的、用培養(yǎng)方法計數(shù)帶來的偏差［11］。彭永臻等列舉了FISH 在活性污泥細菌檢測，高效生物除磷(EBPR)反應器微生物群落的測定、污水處理微生物檢測等方面的應用 。

4 酶聯(lián)免疫吸附技術(ELISA)

4.1 概念及特點

ELISA 是將免疫技術與現(xiàn)代測試手段相結合，把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結合起來的一種超微量的測定技術，并可以定量檢測，在生物學、醫(yī)學應用非常廣泛。ELISA 常用的方法主要包括雙抗體夾心法、競爭法、間接法等。其核心技術是抗原抗體的特異性反應，酶結合于相應抗原或抗體后，加入的底物會有顏色反應，采用現(xiàn)代光學分析儀器對受檢樣品中的酶標免疫反應的試驗結果進行光度測定。ELISA 法具有簡單、快速、穩(wěn)定、靈敏、特異、高通量等特點，因此被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測等領域。

4.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

ELISA 在水和土壤的農(nóng)藥殘留檢測方面取得了很好的效果，已成功應用于甲基對硫磷、甲胺磷、氟蟲腈殺蟲劑、除蟲脲農(nóng)藥等的檢測［13］，有些發(fā)達國家已開發(fā)出商品檢測試劑盒應用于環(huán)境中的農(nóng)藥殘留的檢測分析。間接ELISA 方法測定水產(chǎn)品中甲氰菊酯殘留的最低檢出限為20 Lg·kg－1，接近或達到氣相色譜法的測定水平，可在3 h 內(nèi)完成近百個樣品的分析，極大提高了檢測效率［14］;此法檢測稻田土壤中除草劑毒莠定殘留的結果表明，毒莠定的檢出下限可達5 Ng·mL－1，樣品基質(zhì)對檢測結果沒有干擾;由于間接ELISA 的靈敏性和特異性，也被證實可用于生防菌殺蟲蛋白的監(jiān)測［15］。

5 生物芯片技術

5.1 概念及特點

生物芯片是生物學、微電子學、計算機科學、化學、物理學高度交叉的新興技術。本質(zhì)特征是利用微電子、微機械、化學、物理及計算機，將生命科學研究中不連續(xù)的樣品檢測、分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統(tǒng)，實現(xiàn)檢測的連續(xù)化、集成化、微型化。其原理是將大量的核酸片段、多肽分子、組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與標記好的待測生物樣品中靶分子雜交，通過儀器對雜交信號的強度進行定性和定量分析。常見的生物芯片主要分為:基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片、芯片實驗室等。生物芯片具特異性好、高通量、自動化、平行性好、簡便快速、無污染、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點，在進行大批量篩選環(huán)境樣品和對其進行分型研究中有廣泛應用。

5.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

生物芯片技術已成功應用到環(huán)境監(jiān)測中的病原細菌瞬時檢測、細菌基因表達水平測量、菌種鑒定、水質(zhì)控制等方面。RhodeIsland 大學研究人員將生物傳感器技術和光纖技術相結合，用光纖末端接觸待測物，開發(fā)了一種可即時、精確檢測水中沙門氏菌和大腸桿菌的生物芯片技術［16］;法國一家主要的水管理企業(yè)開發(fā)了一種生物芯片，隨時監(jiān)測公共飲用水中微生物的變化［16］;Anthony 等利用DNA 芯片建立的細菌檢測及鑒定系統(tǒng)，可快速監(jiān)測細菌的種類和濃度［17］。Wang 等將毛細管電泳芯片與厚膜電流檢測器集成在一起，可在140 s 內(nèi)從摻入有機磷神經(jīng)毒物的河水中分離檢測出磷、乙基對硫磷、甲基對硫磷和殺螟硫磷［18］。Backer 等利用基于氧化錫的微反應芯片實現(xiàn)了對空氣中CO、NO 和NO2氣體的測量［19］。

6 生物傳感器

6.1 概念及特點

生物傳感器是基于生物反應進行檢測的一類化學傳感器，以酶、微生物、抗原或抗體等具有生物活性的固定化的生物敏感材料作識別元件，由信號轉(zhuǎn)換元件將外界對其理化性質(zhì)的影響轉(zhuǎn)化成電信號，并通過信號放大裝置放大，而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量測定。根據(jù)生物分子識別的原理，可分為:免疫化學傳感器、酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞傳感器、DNA 傳感器等。生物傳感器與傳統(tǒng)的分析方法相比具有很多優(yōu)點:體積小，可以實現(xiàn)在線連續(xù)監(jiān)測;反應快，可以反復多次使用;成本低，便于推廣普及;樣品用量少，一般不需要樣品的預處理，一般不需加入其他試劑。

6.2 在環(huán)境監(jiān)測中的應用

生物傳感技術可用來測定水體中的BOD、酚、NO3、有機磷，還可以用來分析大氣中的CO2、SO2、NOx 的含量及濃度等。BOD 生物傳感器可在10 ～15 min 檢測出BOD 值，可對水質(zhì)狀況實行在線監(jiān)測［20］;白志輝等用硫化物桿菌制成硫化物傳感器，用于對生活污水、工業(yè)廢水等基體復雜樣品中的硫化物測定［21］。

生物傳感器不僅可用來檢測水質(zhì)的常規(guī)污染指標，還可用于檢測某種或某一類有毒有害污染物，如重金屬、殺蟲劑、除草劑等。Andreas 等報道了將檢測汞的傳感器菌株用于測定土壤中汞的生物有效性［22］;Roberto 等利用綠色熒光蛋白(GFP)，研制出一種細菌熒光素酶生物傳感器，可測定亞微克水平的亞砷酸鹽和砷酸鹽，對砷污染地區(qū)能進行長期的在線監(jiān)測，且效果好、費用低［23］。

在大氣污染監(jiān)測方面。Shiroaki 等使用自養(yǎng)微生物和氧電極的CO2傳感器，傳感器對濃度在3% ～2%之間的CO2。Suzuki 等人利用半導體技術研究出一種使用更為方便的CO2生物傳感器［20］;Charles 等用多孔滲透膜、固定化硝化細菌和氧電極組成微生物傳感器，用此傳感器測定樣品中的亞硝酸鹽含量，可間接測定空氣中NOx 的濃度，其檢出限為1x10－8mol·L－1［24］。

7 結語

除以上介紹的用于環(huán)境監(jiān)測的分子生物技術外，還有流式細胞測定技術、凝膠電流技術、微核技術、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)等。通過對這些方法的闡述，以期讓環(huán)保工作者對現(xiàn)代分子生物學技術應用于環(huán)境監(jiān)測的方向有進一步的了解。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，這些方法在環(huán)境科學中的地位和作用將更加明顯。廣大生物和環(huán)保工作者可通過更深入的研究探索，進一步的完善和優(yōu)化，并與其它監(jiān)測手段配合使用，取長補短，為環(huán)境監(jiān)測提供可靠的技術支持。

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