郭 欣，謝三都

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酶解結(jié)合超聲波提取枇杷花黃酮類物質(zhì)工藝優(yōu)化

郭 欣1，謝三都2

（1．漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2．福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)系，福建 泉州 362332）

以枇杷花為原料、黃酮類物質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察纖維素酶用量、料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲波功率等對(duì)枇杷花黃酮類物質(zhì)提取效果的影響。結(jié)果表明，酶法結(jié)合超聲波技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)最佳工藝條件為：配制料液比1：50，先經(jīng)纖維素酶水解再經(jīng)超聲波處理，纖維素酶用量100mg，酶解溫度60℃，酶解時(shí)間30min，超聲波功率250W、提取時(shí)間20min，黃酮類物質(zhì)得率為8.37%。

枇杷花；纖維素酶；超聲波；黃酮類物質(zhì)；提取工藝

枇杷花為枇杷（）的干燥花蕾及花序[1]。枇杷在開花時(shí)每個(gè)花序有80～100朵花，但僅有3%～5%能形成果實(shí)，為了提高枇杷的產(chǎn)量和質(zhì)量，果農(nóng)們會(huì)在一定時(shí)期進(jìn)行疏花操作，大概每畝枇杷可疏花100Kg[2][3]。這些疏花一般都直接丟棄地頭，或部分作為民間用藥，造成枇杷資源的浪費(fèi)，降低了枇杷的綜合利用率。黃酮類化合物是一類天然、具有抗氧化活性的化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，同時(shí)因其具有高效性和安全性而成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，枇杷葉中的黃酮類化合物具有止咳、祛痰、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，對(duì)肺熱咳喘和腎小球腎炎、過敏性紫癜、蕁麻疹、濕疹及高血糖等病癥具有較好療效[4]。目前國內(nèi)外對(duì)枇杷花中黃酮類物質(zhì)的提取方法主要集中在超聲波輔助提取法[5][6]及水和溶劑浸提法[7][8]等，該類方法大多采用有機(jī)溶劑進(jìn)行浸提，得到的黃酮類物質(zhì)容易出現(xiàn)有機(jī)物質(zhì)殘留，并且實(shí)驗(yàn)廢棄液容易對(duì)環(huán)境造成污染。

經(jīng)干燥的枇杷花，胞內(nèi)物質(zhì)溶出要克服細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞壁的雙重阻力[9]。采用纖維素酶，可以水解細(xì)胞壁，破壞其結(jié)構(gòu)，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，并且纖維素酶屬于蛋白質(zhì)，對(duì)人體及環(huán)境無毒無害。本研究以枇杷花為原料，采用纖維素酶結(jié)合超聲波破壁技術(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響枇杷花黃酮類物質(zhì)得率的料液比、纖維素酶用量、酶解溫度和時(shí)間、超聲溫度和時(shí)間等因素進(jìn)行初步研究，以確定酶解結(jié)合超聲波提取枇杷花黃酮類化合物的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷花，購于福建省福州市草藥店；纖維素酶（湖南利爾康生物有限公司）；蘆丁為生化試劑（天津一方科技）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY88-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；WFZUV-2802SH型紫外可見分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；AL204型精密分析天平、PL602-S型電子天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JSP-100型高速多功能粉碎機(jī)浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；RV10數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷花黃酮類物質(zhì)的提取工藝流程

枇杷花→低溫烘干→粉碎→過40目標(biāo)準(zhǔn)樣篩→酶法結(jié)合超聲波破壁處理→抽濾→抽提液。

1.3.2 枇杷花黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定方法

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣，參照文獻(xiàn)[10]，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中蘆丁質(zhì)量X（mg）與其吸光度值Y間的回歸方程為：Y=10.77X - 0.0144，R=0.9999。

1.3.3 枇杷花黃酮類物質(zhì)得率的計(jì)算

將抽提液定容于250mL容量瓶中得稀釋液，精密吸取2.0mL稀釋液置于10.0mL容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)，以吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，按下述公式計(jì)算枇杷花黃酮類物質(zhì)含量W（%）：

式中：為吸光度；為枇杷花樣品重量，單位為mg；為枇杷花中黃酮類物質(zhì)含量，單位%；125為稀釋倍數(shù)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 纖維素酶提取枇杷花黃酮類物質(zhì)工藝優(yōu)化

以黃酮類物質(zhì)含量為測(cè)定指標(biāo)，進(jìn)行纖維素酶提取的單因素實(shí)驗(yàn)，因素水平如下所示：料液比：1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80；酶用量：50mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg；溫度：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；時(shí)間：20min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min。

在單因素基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取工藝條件，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平表

1.4.2 超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)工藝優(yōu)化

以黃酮類物質(zhì)含量為測(cè)定指標(biāo)，進(jìn)行超聲波破壁技術(shù)提取的單因素實(shí)驗(yàn)，因素水平如下所示：料液比：1：10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70；超聲波功率：100 W、150 W、200 W、250 W、300 W；時(shí)間：5min、10min、15min、20 min、25 min、30min。

在單因素基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波提取工藝條件，試驗(yàn)因素和水平見表2。

表2 試驗(yàn)因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法提取枇杷花黃酮類物質(zhì)工藝優(yōu)化

2.1.1 纖維素酶提取枇杷花黃酮類物質(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)酶解影響較大的因素：料液比、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間，分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，纖維素酶酶解枇杷花提取黃酮類物質(zhì)的較佳水平分別為：料液比1：40，酶用量100mg，溫度50℃，時(shí)間30min。

2.1.2 纖維素酶提取枇杷花黃酮類物質(zhì)正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，研究纖維素酶提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件，所得試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，比較各列的極差結(jié)果R值，可以發(fā)現(xiàn)Ra>Rb>Rd>Rc，即在試驗(yàn)所設(shè)定的因素中，料液比對(duì)枇杷花提取率的影響最大，其次才是酶用量、時(shí)間和溫度。通過對(duì)K值的比較，可知A3、B2、C3、D2為最優(yōu)水平。

為判斷上述四種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，利用F值來檢驗(yàn)各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度，分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析表

表4可以看出，在所選取的四個(gè)因素中，對(duì)枇杷花黃酮類物質(zhì)提取率影響的主次順序?yàn)椋篈>B>D> C，即料液比＞酶用量>時(shí)間＞溫度，這與表3中極差分析的結(jié)果相一致。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，因素A影響顯著，但因素B、C、D不顯著，說明料液比是影響枇杷花黃酮類物質(zhì)的主要因素。根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)結(jié)果為：A3、B2、C3、D2。

取A3B2C3D2最優(yōu)水平做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明纖維酶提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件為：料液比1：50，酶用量100mg，溫度60℃，時(shí)間30min，該條件下枇杷花黃酮類物質(zhì)得率為4.59%。

2.2 超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的工藝研究

2.2.1 超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)提取率影響較大的因素：料液比、超聲波功率、超聲波時(shí)間，分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的較佳水平分別為：料液比1：50，超聲波功率250W，超聲波時(shí)間20min。

2.2.2 超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以第三列為空白列，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，研究超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，比較各列的極差結(jié)果R值，可以發(fā)現(xiàn)Ra>Rb>Rc，即在試驗(yàn)所設(shè)定的因素中，料液比對(duì)枇杷花提取率的影響最大，其次才是超聲波功率和超聲波時(shí)間。通過對(duì)K值的比較，可知A2、B2、C2為最優(yōu)水平。

為判斷上述四種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，利用F值來檢驗(yàn)各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度，分析結(jié)果見表6。

由表6可以看出，在所選取的四個(gè)因素中，對(duì)枇杷花黃酮類物質(zhì)提取率影響的主次順序?yàn)椋篈>B> C，即料液比＞功率>時(shí)間，這與表5中極差分析的結(jié)果相一致。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，因素A影響極顯著，因素B影響顯著，但因素C不顯著，說明料液比、超聲波功率是影響枇杷花黃酮類物質(zhì)的主要因素。根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)結(jié)果為：A2、B2、C2。

取A2B2C2最優(yōu)水平做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的最優(yōu)工藝條件為：料液比1：50，超聲波功率250W，時(shí)間20min，該條件下枇杷花黃酮類物質(zhì)得率為3.62%。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

2.3 酶法結(jié)合超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的工藝研究

在2.1和2.2的基礎(chǔ)上，配制料液比1：50枇杷花溶液兩份：一份先添加100mg纖維素酶，攪勻，于60℃水浴中酶解30min，冷卻后，再經(jīng)超聲波功率250W處理20min；另一份先經(jīng)超聲波功率250W處理20min，再添加100mg纖維素酶，攪勻，于60℃水浴中酶解30min；分別抽濾，測(cè)定枇杷花黃酮類物質(zhì)得率。結(jié)果表明：先經(jīng)纖維素酶水解再經(jīng)超聲波處理，3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得枇杷花黃酮類物質(zhì)得率分別為: 8.51%、8.24%、8.36%，3次取平均值8.37%，而先經(jīng)超聲波處理再纖維素酶水解，3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得枇杷花黃酮類物質(zhì)得率分別為: 5.24%、4.98%、5.14%，3次取平均值5.12%。因此，酶法結(jié)合超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)應(yīng)采用先酶解再超聲波處理的順序：配制料液比1：50枇杷花溶液先添加100mg纖維素酶，攪勻，于60℃水浴中酶解30min，冷卻后，再經(jīng)超聲波功率250W處理20min。該結(jié)果表明，枇杷花溶液經(jīng)纖維素酶水解之后，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)更易溶出，此時(shí)再用超聲波處理，黃酮類物質(zhì)得率提高。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化試驗(yàn)，研究了酶法結(jié)合超聲波破壁技術(shù)提取枇杷花黃酮類物質(zhì)的工藝條件，獲得最佳工藝條件為：配制料液比1：50枇杷花溶液先添加100mg纖維素酶，攪勻，于60℃水浴中酶解30min，冷卻后，再經(jīng)超聲波功率250W處理20min，所得枇杷花黃酮類物質(zhì)得率為8.37%。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 鄭美瑜，陸勝民，陳劍兵，等. 枇杷花總黃酮的提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵科技，2009，45(4):53-54.

[3] 黃福山，袁為明，俞文生，等. 枇杷大棚栽培疏花疏果技術(shù)[J]. 江西園藝，2003(6):10.

[4] 林玉霖，林文津，林力強(qiáng)，等. 枇杷葉的研究現(xiàn)狀與開發(fā)前景[J]. 中藥材，2006，29(10):1111-1114.

[5] 謝田偉，陳發(fā)河，吳光斌. 響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷花黃酮提取工藝研究[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版，2012，17(5):343-350.

[6] TSUYOSHI INOUE，SHUNTARO TSUBAKI，KAZUNORI OGAWA，et al．Isolation of hesperidins from peels of thinned Citrus unshiu fruits by microwave-assisted extraction [J]. Food Chemistry，2010，123(2):542-547．

[7] 林啟訓(xùn). 枇杷葉黃酮類化合物的水浸提工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2005(7):197-200.

[8] 胡娟，張宏，劉剛，等. 枇杷花總黃酮提取工藝的研究[J]. 中藥學(xué)，2008(11):124-127.

[9] 毛延妮. 植物枇杷葉黃酮類化合物提取與抑菌性研究[D]. 福建農(nóng)林大學(xué)，2010．

[10] 徐禮焱. 中草藥有效成分分析法(下冊(cè))[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1984.

Optimization of Extraction Process for the Flavonoids from Loquat Flowers by Ultrasonic Combined with Hydrolysis

GUO Xin1, XIE San-du2

（1．Department of Food and Biological Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou, 363000, China; 2．Department of Chemistry and Life Sciences, Fujian Normal University Minnan science and Technology Institute, Fujian Quanzhou, 362332, China）

The study takes the extraction rate of flavonoids from loquat flowers as evaluation index to discuss how the amount of cellulase, solid-liquid ratio, extraction temperature and ultrasonic power affect the flavonoids extraction. The results show that，the best extraction Process for the Flavonoids from Loquat Flowers by Ultrasonic Combined with Hydrolysis is: the ratio of material to liquid 1:50;Cellulase dosage 100mg;ultrasonic power 250W, the extraction time of 20 min,then the flavonoids extraction rate of 8.37% is achieved.

Loquat Flowers; Cellulase; Ultrasonic; Flavonoids; Extraction technology

TS255.36

A

1673-1417（2013）03-0001-06

2013－07－10

郭 欣（1984—），女，福建閩侯人，助教，碩士，主要從事食品科學(xué)的教學(xué)及科研工作。

（責(zé)任編輯：季平）