雄蜂精液儲(chǔ)存

現(xiàn)在的蜜蜂育種工作面臨著重要挑戰(zhàn)，需要培育可以抵御引進(jìn)的或以前未知的病原體及寄生蟲的蜂種。同時(shí)，可利用的基因多樣性在迅速下降，西方蜜蜂的亞種和生態(tài)型面臨著外來基因型的大量滲入，發(fā)展實(shí)用的精液儲(chǔ)存方法將可以提高育種者選擇和保存優(yōu)良蜜蜂種群的能力。目前已成功嘗試了一些使用超低溫冷凍及非冷凍技術(shù)儲(chǔ)存精液的方法。

精液儲(chǔ)存方法的成功性評(píng)估實(shí)驗(yàn)包括：依據(jù)精子活力評(píng)估精液質(zhì)量、統(tǒng)計(jì)人工授精蜂王受精囊中的精子數(shù)以及比較已授精蜂王所產(chǎn)的工蜂蛹與雄蜂蛹的比例。Harbo還測(cè)量了卵的孵化率。不過，這些活體技術(shù)需要耗費(fèi)大量時(shí)間和精力，有些試驗(yàn)還需要損失很多蜂王。一些研究者還對(duì)未稀釋或輕微稀釋的精液進(jìn)行活力測(cè)量，發(fā)現(xiàn)冷凍-融解的精液與未冷凍精液無差別甚至優(yōu)于未冷凍精液。

精液的有效儲(chǔ)存技術(shù)必須滿足精子存活的最低接受水平。為確定這一水平，Collins（2000）使用新鮮精液和凍死精液的不同比例的混合物對(duì)蜂王進(jìn)行授精，授精后蜂王放入小群中。使用凍死精液（0%新鮮精液）進(jìn)行授精的蜂王受精囊中無精子，只產(chǎn)雄蜂子。使用25-100%新鮮精液授精的蜂王受精囊中活精子和死精子的比例（由雙熒光染色法確定）在授精后27天沒有明顯區(qū)別。使用含50%及以上新鮮精液進(jìn)行授精的蜂王只產(chǎn)工蜂。所以，她認(rèn)為精子儲(chǔ)存應(yīng)該達(dá)到50%的存活水平以保證精液的功能。

蜂王人工授精所用的精液通常是新鮮采集或在室溫條件下保存不到一個(gè)星期。雄蜂精液在室溫下最長(zhǎng)大概可以儲(chǔ)存兩周。2000年，Collins測(cè)試了在非冷凍溫度下精子存活的限度。收集的經(jīng)稀釋的精液儲(chǔ)存在密封的毛細(xì)管中，放在室溫下或12℃冰箱中放置一年。使用SYBR-14及碘化丙啶雙熒光染色法測(cè)定精子存活情況：在最初6個(gè)周內(nèi)精子存活沒有明顯變化。在6～9周，活精子的數(shù)量從80%下降到58%，此水平保持至39周。52周時(shí)，保存在室溫下的精液活精子數(shù)下降到18.9%。非冷凍儲(chǔ)存法可以進(jìn)行短期的精液種質(zhì)保存。根據(jù)體外精液的運(yùn)動(dòng)性和生存力對(duì)儲(chǔ)存時(shí)間、雄蜂日齡和污染對(duì)精液質(zhì)量的影響進(jìn)行研究，分析了4個(gè)日齡組（1周、2周、4周及6周日齡）和5種儲(chǔ)存時(shí)間（0、1、2、4和6周）。隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，精液生存能力和能動(dòng)性明顯下降。但未儲(chǔ)存的精液樣品的運(yùn)動(dòng)模式明顯比儲(chǔ)存2周的精液低。隨雄蜂日齡增加，精液生存力明顯下降，但運(yùn)動(dòng)模式無改變。被外源顆粒或微生物污染的精液樣品的平均生存力明顯比未被污染的樣品低。

精液儲(chǔ)存實(shí)用技術(shù)的發(fā)展可以明顯提高培育特定基因型及保持遺傳多樣性的能力。所以，精液的低溫儲(chǔ)存技術(shù)對(duì)蜜蜂保種和育種工作十分有益。但此類技術(shù)的發(fā)展受到蜜蜂繁殖生物學(xué)的阻礙。蜂王羽化出房后不久進(jìn)行交配，精液儲(chǔ)存在受精囊中，長(zhǎng)達(dá)2～5年。這意味著冷凍與解凍的精液必須能在受精囊中長(zhǎng)期儲(chǔ)存并能產(chǎn)出數(shù)以萬計(jì)的受精卵。

Harbo（1977）使用液氮儲(chǔ)存的精液對(duì)蜂王授精，成功產(chǎn)下工蜂。低溫保護(hù)劑為DMSO（二甲基亞砜）。使用精液混合物（60%精液，30%鹽溶液，10%DMSO）授精的蜂王與對(duì)照組蜂王相比，受精囊中有41%的精液。不使用DMSO時(shí)，精液無存活。遺傳標(biāo)記顯示蜜蜂精液在-196℃儲(chǔ)存兩年后可以產(chǎn)生后代，使用儲(chǔ)存4天的精液對(duì)9只蜂王人工授精，產(chǎn)生22%的工蜂子（范圍在8～55%之間），使用儲(chǔ)存兩年的精液對(duì)8只蜂王人工授精，產(chǎn)生8%的工蜂子（范圍在1～25%之間）。

進(jìn)一步的研究對(duì)此儲(chǔ)存技術(shù)進(jìn)行了改良，蜜蜂精液進(jìn)行以下處理：（1）與10%的DMSO在鹽溶液中進(jìn)行稀釋，儲(chǔ)存在-196℃；（2）同樣的處理，但儲(chǔ)存在12℃；（3）在鹽溶液中進(jìn)行稀釋，儲(chǔ)存在12℃；（4）未稀釋、未儲(chǔ)存的精液。對(duì)各處理的子代蜂王進(jìn)行不育性評(píng)估，含DMSO的兩組中3%的蜂王產(chǎn)雄蜂卵（第一組為5/166，第二組為6/234），與第三組和第四組差異顯著，后兩組沒有產(chǎn)生后代蜂王，只產(chǎn)雄蜂卵（分別為0/151和0/ 137）。結(jié)果顯示，在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下，DMSO引起較低的不育水平。

考慮到西方蜜蜂種內(nèi)多樣性所受的威脅以及抗病育種所受的壓力，進(jìn)行雄蜂精液冷凍保存技術(shù)研究十分重要。雄蜂精液最常使用的冷凍保護(hù)劑為DMSO，使用膜滲透性實(shí)驗(yàn)，Wegener和Bienefeld（2012）測(cè)量了4種可能的DMSO替代物1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙二醇和二甲基甲酰胺的短期毒性。他們還檢測(cè)了使用含低溫保護(hù)劑的精液人工授精對(duì)蜂王受精囊中精子的數(shù)量或精子活力的影響。另外，還測(cè)試了DMSO和乙二醇混合物是否降低低溫保護(hù)劑在活體內(nèi)的毒性。結(jié)果顯示，雖然低溫保護(hù)劑的短期毒性都很低，但授精精液中單種低溫保護(hù)劑的使用可大大降低到達(dá)蜂王受精囊中的精子數(shù)量。DMSO也有此效應(yīng)。乙二醇還可降低到達(dá)受精囊的精子的活力。他們認(rèn)為，過去低估了低溫保護(hù)劑對(duì)蜜蜂精子和蜂王的毒性。

雄蜂精液的低溫保存受多個(gè)因子影響：冷凍速率優(yōu)化、融解速率優(yōu)化、低溫保護(hù)劑的性質(zhì)和濃度以及稀釋液的組成。Wegener等（2012）分析了7種體外測(cè)試與授精后精子性能的相互關(guān)系。測(cè)試包括：運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞構(gòu)造、暴露于生理化學(xué)壓力前后膜的滲透性。他們指出運(yùn)動(dòng)性測(cè)試結(jié)果和到達(dá)蜂王受精囊中的精子數(shù)量以及授精蜂王中可育卵子的比例明顯相關(guān)（相關(guān)系數(shù)q分別為0.67和0.48）。傳統(tǒng)的雙熒光染色法和新的基于損傷細(xì)胞中磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（GPI）滲漏的測(cè)試也和到達(dá)蜂王受精囊中的精子數(shù)相關(guān)（q分別為0.54和0.61）?？偟恼J(rèn)為，運(yùn)動(dòng)性、雙熒光染色和GPI-滲漏測(cè)試是提高蜜蜂精液低溫保存的有用工具。

Hopkins和Herr（2010）研究了可能影響精子融解后活力的因子，包括低溫保護(hù)劑的類型和濃度、冷休克的影響、冷凍速率和溫度敏感性。他們分析了兩種冷卻速率：程序性冷卻和快速冷卻。程序性冷卻是緩慢冷卻樣品，促使胞外結(jié)冰而有效使細(xì)胞脫水、防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。而快速冷卻是迅速降低溫度、使細(xì)胞內(nèi)外無法形成冰晶，最低冷卻速率估計(jì)為30,000℃/min。這個(gè)最低冷卻速率依賴于低溫保護(hù)劑的類型和濃度。為了達(dá)到這一速率，樣品必須很小，有足夠的表面積。實(shí)驗(yàn)顯示，使用含10%DMSO、緩慢冷卻至結(jié)冰溫度之上、以3℃/ min的速率進(jìn)行冷卻處理的精液活力較高（93%）。此方式冷卻的精液和未冷凍精液相比，活力及能動(dòng)性無明顯差異。

丁桂玲 譯