沈克飛 翟少欽 曹 蘭 楊 柳 張邑帆

（重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460）

囊狀幼蟲病是中蜂的重要疾病，造成嚴(yán)重且典型的臨床癥狀，威脅幼蟲發(fā)育和蜂群群勢(shì)，甚至導(dǎo)致蜂群飛逃。中蜂囊狀幼蟲病最早于1972年發(fā)生于廣東省，隨后迅速蔓延到全國(guó)和東南亞的中蜂飼養(yǎng)國(guó)家和地區(qū)。在1972年至1976年的該病流行期間，中國(guó)境內(nèi)飼養(yǎng)中蜂損失超過百萬群。后來疾病的損耗降低，但蜂群的發(fā)病率仍在50%～70%。

引發(fā)蜜蜂囊狀幼蟲?。⊿acbrood）的病原是蜜蜂囊狀幼蟲病病毒（Sacbrood virus，SBV），感染中蜂的SBV常被稱為中蜂囊狀幼蟲病病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）。SBV為正鏈單股RNA病毒，屬于昆蟲小RNA樣病毒（Picorna-like virus），被劃入傳染性軟化病病毒屬（Ifl avirus）。該病毒基因組除去Poly A尾大約含有8830個(gè)堿基，只有1個(gè)大的開放閱讀框架（Open Reading Frame），編碼大約2860個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白（Polyprotein）。在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下，多聚蛋白氨基端剪切、加工產(chǎn)生成熟的結(jié)構(gòu)蛋白，羧基端剪切、加工產(chǎn)生為非結(jié)構(gòu)蛋白。目前，對(duì)蜜蜂病毒性病原的研究主要集中在病原檢測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，很少涉入病毒的分離培養(yǎng)。病毒的雞胚培養(yǎng)法是應(yīng)用于病毒病的診斷、預(yù)防和防治方面的有效手段，也是研究病毒生物學(xué)特性的途徑之一。本實(shí)驗(yàn)開展了CSBV雞胚培養(yǎng)方法的嘗試，以期提供簡(jiǎn)便的CSBV體外培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

采自重慶地區(qū)暴發(fā)囊狀幼蟲病的中蜂場(chǎng)，具有典型囊狀幼蟲病特征，經(jīng)RT-PCR法鑒定為SBV陽性[1]，于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、pMD18-T載體、Trizol和PrimeScript RT-PCR Kit均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司。CSBV部分結(jié)構(gòu)蛋白抗血清由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所制備并保存[2]。

1.3 病毒分離

病死中蜂幼蟲及其滲出液與生理鹽水按1：10比例加入，于研磨器中研磨5 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清，加入終濃度1000 單位雙抗，37 ℃孵育30 min后，經(jīng)尿囊腔接種活力旺盛的9日齡雞胚5枚，0.2 mL/枚，37 ℃培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)正常雞胚對(duì)照。無菌收集尿囊液，并盲傳5代。

1.4 分子病毒學(xué)鑒定

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)CSBV廣州株基因組序列（GenBank登錄號(hào)：AF469603）設(shè)計(jì)擴(kuò)增CSBV-CQ編碼序列的引物。引物由生工生物工（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

1.4.2 總RNA的提取

表1 用于CSBV RT-PCR擴(kuò)增的引物

取3 00 μL尿囊液加入7 00 μL Trizol混勻，室溫靜置15 min后，加入250 μl氯仿，充分振蕩后室溫靜置15 min；加入250 μl氯仿充分振蕩后靜置15 min；4℃，12 000 r/mim離心15 min；取上清，加入等體積的異丙醇，混勻后于-20 ℃靜置1 h；4℃，12 000 r/min離心10 min。沉淀用70%的乙醇洗滌一次，吸干上清，沉淀溶解于100 μl經(jīng)DEPC處理的去離子水中，以備反轉(zhuǎn)錄。

1.4.3 RT-PCR法病毒檢測(cè)

使用PrimeScript RT-PCR Kit及其Random 6mers，以提取的尿囊液總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR擴(kuò)增CSBV-CQ編碼序列。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer（含15 mM Mg2+）2.5 μl，2.5 mM dNTPs 0.5 μl，5 U/μl rTaq 0.1 μl，10 μM的上、下游引物各0.5 μl，cDNA 0.5 μl，補(bǔ)去離子水至25 μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。所用引物見表1。

1.4.4 條帶與序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的條帶，將其克隆至pMD18-T載體，用質(zhì)粒上的通用引物M13+/ M13-進(jìn)行雙向序列測(cè)定，將所得序列在NCBI上作BLAST搜索以進(jìn)行同源性分析。

1.5 免疫印跡分析

CSBV感染致死幼蟲樣本和接種CSBV尿囊液分別經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印NC膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h；TBST洗滌3次；加入CSBV抗血清（1：1000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1：5 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；置BCTP/NBT顯色液中顯色。

2 結(jié)果

2.1 雞胚接種

CSBV第一次接種9日齡雞胚尿囊腔后，在前4天孵化期間雞胚未死亡，發(fā)育速度正常，胚體無明顯出血點(diǎn)，肝臟有出血點(diǎn)。正常對(duì)照胚體及肝臟無出血點(diǎn)。連續(xù)盲傳5代，雞胚無死亡，現(xiàn)象同第一次接種。

2.2 病毒RT-PCR鑒定結(jié)果

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見使用CSBV特異的引物從接種雞胚尿囊液提取的總RNA中擴(kuò)增出清晰、特異、大小與預(yù)期相符的條帶（圖1），而未接種雞胚未擴(kuò)增出條帶。5次盲傳尿囊液均擴(kuò)增出相同條帶圖譜。經(jīng)序列測(cè)定及序列分析得出，所擴(kuò)增片段是SBV基因片段，片段拼接后獲得一條長(zhǎng)度約占SBV基因組90%的片段，與CSBV-CQ分離株（GenBank登錄號(hào)：KC285046）同源性（高于99.5%）高于其他分離株。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 M：DNA marker DL2000；1-9：分別為引物SB1F/SB1R-SB9F/SB9R的產(chǎn)物

2.3 免疫印跡分析

CSBV抗血清與CSBV 感染致死幼蟲樣本和CSBV接種雞胚尿囊液強(qiáng)烈反應(yīng)而產(chǎn)生一條特異條帶，但接種雞胚尿囊液CSBV滴度不及感染致死幼蟲樣本CSBV滴度，接種雞胚尿囊液稀釋2倍后特異條帶亮度極弱；未接種雞胚尿囊液無任何條帶出現(xiàn)（圖2）。

3 討論

圖2 免疫印跡結(jié)果

囊狀幼蟲病正困擾著中蜂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其危害日益受重視。病原分離培養(yǎng)是進(jìn)行病原學(xué)研究的基礎(chǔ)。賴德真等于1982年報(bào)道了用雞胚組織培養(yǎng)囊狀幼蟲病病毒[3]。本實(shí)驗(yàn)將囊狀幼蟲病致死的中蜂幼蟲懸液接種9日齡雞胚，盲傳5代均可見雞胚肝臟有出血點(diǎn)，用RT-PCR法從接種尿囊液中擴(kuò)增出了CSBV的基因組片段，運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)到接種雞胚尿囊液存在CSBV顆粒，表明CSBV在雞胚尿囊腔中可增殖。但接種雞胚尿囊液免疫印跡條帶亮度不及病死幼蟲樣本條帶亮度，顯示尿囊液中的病毒滴度較低。目前，SBV的體外培養(yǎng)主要依靠不能傳代的蜜蜂中腸細(xì)胞[4]，該細(xì)胞的培養(yǎng)需要極高的專業(yè)技能，而本實(shí)驗(yàn)為CSBV提供了簡(jiǎn)便的培養(yǎng)法，為進(jìn)一步開展CSBV病原學(xué)和分子遺傳學(xué)研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

在自然感染中，SBV容易發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致病毒的致病性、細(xì)胞嗜性、生物學(xué)特性等發(fā)生較大改變。依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析可將感染西方蜜蜂和東方蜜蜂的SBV總體上分為歐洲基因型和亞洲基因型病毒，亞洲的西方蜜蜂蜂群中存在2個(gè)基因型病毒，而東方蜜蜂體中存在2個(gè)基因型基因片段[5-10]。研究指出，SBV具有型特異的遺傳變異特性[10]，也同其它小RNA病毒一樣基因型間存在基因重組，這給適應(yīng)新的蜜蜂種類提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)和條件。

[1]曹蘭，張邑帆，戴榮國(guó)，等.用RT-PCR方法鑒定中蜂囊狀幼蟲病病毒.中國(guó)蜂業(yè)，2011，62（7-9）：33-35

[2]沈克飛，張邑帆，曹蘭，等.中蜂囊狀幼蟲病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)及其抗血清的制備.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26（1）：89-92.

[3]賴德真，史伯倫，李桂仙.中蜂囊狀幼蟲病病毒組織培養(yǎng)的研究.中國(guó)養(yǎng)蜂，1982，2：23-24

[4]張國(guó)只.中華蜜蜂中腸細(xì)胞培養(yǎng)及CSBV感染中華蜜蜂和意大利蜜蜂幼蟲的蛋白質(zhì)組分析[D].中山大學(xué)，廣東，2009.

[5]Kojima Y，Toki T，Morimoto T，et al.Infestation of Japanese native honey bees by tracheal mite and virus from non-native European honey bees in Japan[J].Microb Ecol.2011，62（4）：895-906.

[6]Choe SE，Nguyen TT，Hyun BH，et al.Genetic and phylogenetic analysis of South Korean sacbrood virus isolates from infected honey bees（Apis cerana）[J].Vet Microbiol.2011，[Epub ahead of print][7 Choe SE，Nguyen LT，Noh JH，et al.Analysis of the complete genome sequence of two Korean sacbrood viruses in the Honey bee，Apis mellifera[J].Virology，2012，432（1）：155-161.

[8]Grabensteiner E，Ritter W，Carter MJ，et al.Sacbrood virus of the honeybee（Apis mellifera）：rapid identification and phylogenetic analysis using reverse transcription-PCR[J].Clin Diagn Lab Immunol.2001，8（1）：93-104.

[9]曹蘭，沈克飛，張邑帆，等.蜜蜂囊狀幼蟲病病毒的基因型分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（1）：41-44.

[10]羅文華，張邑帆，沈克飛，等.重慶地區(qū)中蜂囊狀幼蟲病病毒型特異性遺傳變異分析[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26（3）：315-323.