羅照明 張紅城

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析不同產(chǎn)地蜂膠的多酚類成分

羅照明 張紅城

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

建立了蜂膠中的酚酸和黃酮的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）定量方法。不同來源的蜂膠樣品置于乙醇中，在70℃的條件下提取2h，提取物通過5μmC18對稱性的250 mm×4.6 mm柱子分離。通過線性梯度洗脫方法分離，二極管陣列檢測器（DAD）設(shè)置在200~450 nm，MS測定范圍設(shè)在100~1000 Da。其中的大部分化合物主要是通過與標準品的HPLC色譜圖的保留時間（RT）和紫外光譜對照進行定性的。沒有標準品的，通過色譜的在線的紫外數(shù)據(jù)和質(zhì)譜進行確認。歐洲、中國和阿根廷蜂膠的主要特點是含有黃酮和酚酸，主要成分為柯因（2~4%），松屬素（2~4%），短葉松素乙酸酯（1.6~3%）及高良姜素（1~2%）。巴西蜂膠主要含有阿替匹林C、咖啡?？崴岷忘S酮類物質(zhì)。如果考慮將黃酮的總含量納入質(zhì)量標準，我們認為低于11%的黃酮含量的蜂膠是次品，黃酮含量在11~ 14%為可以接受的，黃酮含量在14~17%的屬于質(zhì)量好的，高于17%屬于高質(zhì)量的。LC－DAD－MS分析方法可以用于蜂膠的化學(xué)成分的分析和商業(yè)上的蜂膠制品的質(zhì)量鑒定。

蜂膠；多酚；LC－DAD－MS

1 引言

蜂膠是蜜蜂從植物幼芽與樹干裂縫處采集的樹膠與其上顎腺分泌物（如β-糖苷酶）和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜜蜂用蜂膠來堵塞蜂箱的縫隙，維持蜂箱的溫度，阻止外來生物的侵入，而且抑制內(nèi)部微生物的生長，并將大型的入侵者包裹以防止其腐敗。蜂膠是一種傳統(tǒng)的用于治療各種疾病的民間藥材，大量的研究表明，蜂膠有抑制細菌真菌生長、抗病毒、抗炎、局部麻醉、抗氧化、免疫刺激、止齲、抗癌等生物活性。

蜂膠包含不同種類的化學(xué)成分，包括酚酸及其酯類、黃酮類（黃酮、黃烷酮、黃酮醇、二氫黃酮、查爾酮）、萜烯類、芳香醛、芳香醇、脂肪酸、二苯乙烯和β-類固醇。蜂膠不能直接使用，需要提取純化來除去惰性成分并保護多酚類成分。事實上，和其他成分相比，蜂膠里多酚類成分被認為是具有治療作用的生物活性成分。因此，此類物質(zhì)被廣泛的研究，也建立了很多有效的分析方法。本文主要目的是研究不同地區(qū)采集的蜂膠樣品的質(zhì)量。為了這個目的，建立了蜂膠樣品中黃酮和酚酸定性及定量的LC－DAD－MS分析方法。通過分子離子峰（MS）和相應(yīng)的離子碎片（MS/MS）對不同的化合物進行確認。

2 材料和方法

2.1 化學(xué)藥品

柯因（C），高良姜素（G），松屬素（P），槲皮素（Q），山奈酚（K），異鼠李素（I），櫻花素（S），異櫻花素（iS）,芹菜素（A），刺槐素（Ac），5,7-二甲氧基松屬素（P-DME）和7-甲氧基柯因（C-7ME）購買于里昂諾德公司（Genay，F(xiàn)rance）?？Х人岜揭阴ィ–APE），咖啡酸（CA），P-香豆酸（pC），阿魏酸（FA），肉桂酸（CiA），異阿魏酸（iFA）和3,4-二甲基咖啡酸（DMCA）購買于Sigma公司。水由MilliQ設(shè)備制備。蜂膠樣品由Specchiasol s.r. l贈送。

2.2 蜂膠樣品

蜂膠樣品于最近5年從中國（12），韓國（1），阿根廷（25），巴西（9），智利（7），烏拉圭（4），巴拉圭（1），法國（6），波蘭（12），德國（1），馬其頓（4），俄羅斯（1），克羅地亞（12），意大利（9），保加利亞（1），加拿大（2）購買，并儲存在－20℃溫度下。

2.3 樣品準備

取冷凍的蜂膠樣品200 g，用磨粉機將其充分粉碎，稱量5g于70mL乙醇中，置于70℃的溫度下2h，然后冷卻，過濾，固體殘渣用同樣體積的乙醇提取兩次。然后將3次（每次70mL）的提取液準確定容至100 mL，過0.22μm的膜，用甲醇稀釋50倍，10μL注入HPLC系統(tǒng)中。

2.4 LC-DAD-MS分析

色譜系統(tǒng)是配備有二極管陣列檢測器2996、三倍的四級桿質(zhì)譜分析器的Alliance 2695。分離的色譜柱為5μmC18對稱性的250 mm×4.6 mm柱子，流速設(shè)置為1.2 mL/min，柱溫維持在30℃，分流的比例為5:1。分離方法為線性梯度洗脫（洗脫程序如下：20%B 6 min，在4min內(nèi)20~30%B，在30min內(nèi)30~40%B，在20min內(nèi)40~60%B，在20min內(nèi)60~90%B，10min內(nèi)90%B。色譜數(shù)據(jù)的紫外檢測范圍在200~450 nm，檢測波長290nm。質(zhì)譜設(shè)置為陰離子和陽離子下模式，范圍在100~1000 Da。毛細管出口電壓3.0 kV，孔電壓在20V，離子源的溫度為130℃，解離的溫度350℃。數(shù)據(jù)通過具有對離子碎片分析的Quan-Optimize選項的Masslinx 4.0軟件(Micromass)獲得。每一個酚酸和黃酮的標準品的母液為20mg溶于20mL的甲醇中，然后稀釋進入色譜系統(tǒng)獲得標準曲線，標準曲線的范圍在2~ 50μg/mL。

2.5 方法驗證

LC-DAD-MS方法是經(jīng)過線性、量化及檢測、準確度、峰純度和重復(fù)性驗證過。量化的限定值（S/N的比率為6）和檢測限（S/N的比率為3），通過標準溶液的稀釋獲得。準確度通過包含有CA，pC，F(xiàn)A，iFA，DMCA，CiA，CAPE，Q，C，P，G，C-7ME和P-DME標準品的混合物，分別以三種含量（2，10，20 mg）加入到5g的蜂膠標準品進樣進行評價。加入標準品的蜂膠在最佳的條件下提取，然后通過黃酮和酚酸評價回收率。峰的純度和確認由LC-DAD-MS和LC-MS/MS進行分析。通過連續(xù)5天分析蜂膠樣品來驗證實驗的精度。通過評價標準品保留時間的差異來驗證重復(fù)性。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品準備

通過不同蜂膠樣品出現(xiàn)過的黃酮和酚酸，來混合標準品。第一組和第二組的提取率分別為92.8±2.1%和7.2±2.1%，第三組的黃酮和酚酸沒有檢測。

3.2 方法驗證

每一個標準品以5個濃度梯度來繪制標準曲線，3次獨立地測定每一種濃度。標準曲線的線性關(guān)系用回歸方法分析，標準曲線的方程如表1。加入標準品的蜂膠的黃酮和酚酸的提取的準確度分別為98.2±3.1%和97±2.4%。通過一天之中5次和連續(xù)5天的再現(xiàn)性考察實驗儀器的精密度，變異系數(shù)低于5.4%。量化限（LOQ）和檢測限（LOD）分別為2和0.8μg/mL。關(guān)于重復(fù)性，在三次的進樣中，最大的相對標準偏差為2%（柯因，松屬素和高良姜素）。

表1 蜂膠提取物中不同多酚的標準品的線性回歸方程（Y=mX+q）a

圖1 不同地區(qū)來源蜂膠樣品中發(fā)現(xiàn)的黃酮、酚酸及其酯類的結(jié)構(gòu)

圖2 南美洲（A：阿根廷，B：巴西）和歐洲（C：意大利）蜂膠醇提物的290nm處的HPLC色譜圖。峰名稱及結(jié)構(gòu)見圖1。

圖3 短葉松素-5-甲氧基乙酯（MW328，峰18）在低碰撞能量（10ev）下的斷裂模式。離子碎片[m/z]-59就是乙酯部分。

圖4 短葉松素-3-丙酸酯（MW328，峰35）解離模式

3.3 LC-DAD-MS和LC-MS/MS分析

蜂膠中的多酚的成分主要是一些肉桂酸的衍生物和黃酮，它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示。這些成分非常復(fù)雜，其成分的確認需要HPLC結(jié)合在線的紫外檢測器及MS/MS方法。另外，也有可能出現(xiàn)錯誤的鑒別，這種情況在一篇基于LC-ESI-MS方法的文獻中報道柚皮素的存在。我們的研究表明，柚皮素在蜂膠中不存在，可能的原因是引用的文獻提到的，而且易與短葉松素混淆。柚皮素和短葉松素有相同的分子量、紫外光譜及相似的保留時間。因此，LC-DAD-ESI-MS方法仍是不充分的，LC聯(lián)合在線的MS/MS檢測方法仍需要仔細辨別這些成分。事實上，結(jié)合MS分析柚皮素的離子碎片[m/ z]-151，而短葉松素產(chǎn)生的典型的離子碎片有[m/z]-253。

（未完待續(xù)）

羅照明（1986－），碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。

張紅城，E-mail：zzhc@sohu.com