王利紅，姜 華，王艷麗，孫國昌

（1．杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036；2．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州310021）

立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniKühn）是一種植物病原真菌，能侵染27科以上的植物，其中包括許多重要的糧食作物如水稻、小麥、玉米等［1］．R．solani被普遍認(rèn)為是一個集合種（collective species）［2］，不同寄主來源的R．solani在形態(tài)、致病性和生理方面存在極大的差異［3－4］．1936年Schultz［5］首次提出了菌絲融合群（Anastomosis group，AG）的概念，即根據(jù)不同來源R．solani菌株的菌絲融合情況，將其分成不同的融合群［6－7］．盡管菌絲融合群的提出與廣泛應(yīng)用便利了R．solani遺傳多樣性的研究，但由于該菌在群體遺傳和地域差異上表現(xiàn)出巨大的復(fù)雜性，人們一直在探求研究R．solani遺傳多樣性的新方法和技術(shù)．

真菌核糖體rDNA－ITS序列包括18SrDNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（internal transcribed spacer 1，ITS1區(qū)）、5．8SrDNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2區(qū)）和28SrDNA（圖1）．鑒于最終成熟的核糖體并不包括轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（ITS1和ITS2），因此相對于18S、5．8S和28SrDNA區(qū)域的高度保守性，ITS區(qū)域有著非常豐富的遺傳變異，從而為R．solani遺傳多樣性研究提供了理論基礎(chǔ)［8］．雖然18S和28SrDNA區(qū)不及ITS區(qū)域遺傳多樣性豐富，但該區(qū)域也可以在融合群水平上研究R．solani的遺傳多樣性［9－10］．因此，本文以整個rDNA－ITS區(qū)域為對象，綜述rDNA－ITS技術(shù)的實現(xiàn)、在實際研究中的應(yīng)用及目前的研究進(jìn)展．

圖1 R．solanirDNA－ITS及該區(qū)域PCR擴(kuò)增引物示意圖Fig．1 The sketch map of rDNA－ITS and PCR primers for amplification of this region of R．solani

1 利用rDNA－ITS研究R．solani遺傳多樣性的方法

1．1 直接測序

直接測序是目前最為快速的rDNA－ITS分析方法之一．在R．solanirDNA－ITS測序過程中，選擇合適的引物是首要條件，相關(guān)研究中使用的rDNA－ITS擴(kuò)增的引物列于表1．根據(jù)實驗?zāi)康?，選擇合適的引物，利用PCR儀擴(kuò)增R．solani的rDNA－ITS并采用雙脫氧終止法［11］對PCR產(chǎn)物直接測序．雖然測序費(fèi)用相對較高、整理數(shù)據(jù)略顯復(fù)雜，但過程簡單、快速、準(zhǔn)確率高且獲得的信息量大，因此，被廣泛應(yīng)用于R．solaniAG－1［12］，AG－2［13－14］和AG－4［15］遺傳多樣性的研究中．

表1 擴(kuò)增R．solanirDNA－ITS區(qū)域常用引物Tab．1 The list of common used primers for amplifying the rDNA－ITS region of R．solani

1．2 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）

RFLP是基于rDNA－ITS序列的酶切位點由于堿基突變或發(fā)生插入、缺失、易位和倒位等，導(dǎo)致酶切片段發(fā)生變化，從而可以通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜的差異，比較不同R．solani菌株DNA水平的多態(tài)性．Liu等［13］首次通過rDNA－ITS的RFLP酶切圖譜來研究R．solani的遺傳多樣性，隨后RFLP就被廣泛地應(yīng)用于該菌遺傳多樣性的研究中［20－25］．rDNA－ITS由于片段小，其RFLP無需利用探針進(jìn)行雜交［26］，實驗過程簡單，數(shù)據(jù)分析便捷．rDNA－ITS片段RFLP分析的一般流程：利用適合引物（表1）擴(kuò)增rDNA－ITS區(qū)域；選擇不同的限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分不同酶切片段；分析相關(guān)R．solani菌株的遺傳多樣性．雖然RFLP法依賴于限制性內(nèi)切酶，多態(tài)性降低，但該法結(jié)果穩(wěn)定且重復(fù)性好．

1．3 直接測序和RFLP數(shù)據(jù)處理

1．3．1 直接測序

測序的快速發(fā)展，幫助研究者獲得了大量rDNA－ITS序列信息．目前較為普遍的rDNA－ITS序列分析流程：選取測序結(jié)果準(zhǔn)確的區(qū)間，利用CLUSTALW進(jìn)行不同菌株間rDNA－ITS序列比對；根據(jù)比對結(jié)果利用MEGA軟件［27］計算轉(zhuǎn)換／顛換值（transition／transversion，Ti／Tv）及堿基平均含量；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用以描述各融合群間的進(jìn)化關(guān)系；利用DnaSP軟件分析rDNA－ITS序列的變異位點，推導(dǎo)單倍型數(shù)目，計算單倍型多樣性、核苷酸多樣性，進(jìn)而研究R．solanirDNA－ITS序列代表的菌株遺傳多態(tài)性．

1．3．2 RFLP

利用RFLP可獲得大量酶切片段，將每個酶切片段看作一個遺傳位點，不同大小的酶切片段按有無分別記為1和0，形成多態(tài)性矩陣，并計算菌株間相似程度［28］，獲得相似系數(shù)矩陣：F（相似系數(shù)）＝2nxy／（nx＋ny），其中nxy為兩個菌株間共有的片段數(shù)，nx，ny分別為兩個菌株各自的片段數(shù)；聚類分析，從而把不同的R．solani菌株依據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近聚類成不同的類群［29］．

2 rDNA－ITS在R．solani遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

2．1 直接測序在研究R．solani遺傳多樣性中的應(yīng)用

利用rDNA－ITS區(qū)域序列測定研究R．solani不同融合群的遺傳多樣性表明AG－1［12，30－31］、AG－2［13－14］、AG－3［32］、AG－4［8］和AG－6［33］菌株間存在很大的變異性．Kuninaga等［8］研究了AG－1的8個菌株，發(fā)現(xiàn)ITS1片段大小為198～227bp，ITS2為267～283bp；相同亞群的ITS1同源性為99．5%～100%，ITS2同源性為96．4%～100%；不同亞群的ITS1同源性為66．7%～80．4%，ITS2同源性為88．6%～92．6%．這表明在AG－1中，相同亞群ITS序列同源性極高，不同亞群ITS序列變異性較大，通過鄰接樹也顯示AG－1的3個亞群之間存在一定的遺傳距離．同時對AG－3的9個菌株的序列分析顯示ITS1大小為218～222bp，ITS2為270～272bp，且分離自番茄和煙草的菌株有相同的ITS序列，分離自馬鈴薯的菌株，ITS1序列同源性為96．8%～98．6%，ITS2同源性為99．6%～100%；不同寄主菌株間ITS序列分析表明分離自馬鈴薯和番茄的菌株序列同源性為96．8%～98．5%，但與分離自煙草的菌株同源性為91．0%～95．2%；鄰接樹分析顯示分離自馬鈴薯和煙草的AG－3菌株彼此系統(tǒng)進(jìn)化距離遠(yuǎn)，這表明rDNA－ITS可有效地用于評估融合亞群的遺傳多樣性．Carling等［34］對AG－13的ITS分析顯示ITS1為210bp，ITS2為282bp；對來源AG－13的6個菌株的序列分析表明其ITS1序列完全相同，ITS2序列同源性達(dá)到99%～100%；當(dāng)AG－13的ITS序列與其它融合群進(jìn)行比較時，ITS1序列同源性達(dá)到68%～85%，ITS2同源性達(dá)到85%～95%；通過鄰接樹顯示AG－13與AG－4不在一個群里，但與其它融合群都可以聚在同一個群里．Fiers等［35］利用rDNA－ITS測序法分析分離自土豆塊莖的73株R．solani遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)60個菌株屬于AG－3PT，8個菌株屬于AG2－1，5個菌株屬于AG－5，其遺傳多樣性極其豐富．

根據(jù)rDNA－ITS區(qū)域序列的特異性，設(shè)計以診斷為目的的PCR引物，可檢測和鑒定某些融合群和亞群．Carling等利用ITS2、3、4、5、NS7［16］和LR3［19］擴(kuò)增AG－2－1、－2－2IIIB、－2－2IV、－2－2LP、－2－3和－2－4的ITS序列，通過比較ITS1和ITS2之間序列的差異，設(shè)計了可特異性擴(kuò)增各亞群的引物（表2），能快速、可靠地鑒定AG－2的亞群［36］．類似地，Kuninaga等［32］設(shè)計了可特異性擴(kuò)增亞群3－PT和3－TB的引物PT1／PT2和TB1／TB2（表2），用于快速鑒定AG－3的亞群．Lees等［37］設(shè)計了可特異性擴(kuò)增AG－3的引物Rs1F2／Rs2R1（表2），用于與其它融合群區(qū)分．

2．2 RFLP在研究R．solani遺傳多樣性中的應(yīng)用

Liu等［13］采用DNA限制性內(nèi)切酶分析AG－2的70個菌株，酶切圖譜顯示2A、2B、2C、2D和2E有相同的5．8SrDNA，但PCR擴(kuò)增的rDNA－ITS片段大小有所不同，2A和2E片段均為690bp，2B、2C和2D片段大小為740bp，表明這5個亞群在ITS區(qū)域存在差異．通過EcoRI可區(qū)分2A和2E亞群，MspI或TaqI可區(qū)分2B、2C和2D亞群．Liu等［12］還根據(jù)rDNA－ITS限制性圖譜對來源于不同地區(qū)的9個融合群進(jìn)行研究：在AG－3中PCR擴(kuò)增rDNA－ITS，雖然擴(kuò)增片段大小均為700bp，但可通過MboI酶切區(qū)分出兩個亞群3A和3B；在AG－4中PCR擴(kuò)增出700bp和720bp 2條片段，且通過MboI酶切分成兩個亞群4A和4B；在AG－5中PCR擴(kuò)增出3條大小不同的片段，分別為680、710、650bp，通過HaeIII和MspI酶切可把AG－5分成3個不同亞群5A、5B和5C．此外，Liu等［12］還發(fā)現(xiàn)AG－9的6個菌株在rDNA－ITS區(qū)域有相同的DNA限制性圖譜，屬于同一個群；AG－10通過PCR擴(kuò)增出的片段最短，經(jīng)HinfI酶切和MspI、TaqI雙酶切，可分為兩個亞群10A和10B；AG－BI通過PCR擴(kuò)增出的片段最長，為740bp，可與其它融合群相區(qū)別．Guillemaut等［38］比較了不同地理位置和寄主范圍的219株菌株rDNA－ITS區(qū)域的限制性內(nèi)切酶圖譜，顯示內(nèi)切酶MseI、AvaII、HincII和MunI在rDNA－ITS區(qū)產(chǎn)生了40個RFLP類型．另外，通過Fnu4HI酶切可區(qū)分AG－6和AG－12，MseI、AvaII、HincII和MunI共同酶切還可區(qū)分AG－1、AG－2、AG－3和AG－4的亞群．

表2 鑒定融合群和亞群的特殊引物Tab．2 The specifical primers for identification anastomosis group and subgroups

此外，通過18SrDNA－RFLP和28SrDNA－RFLP也可以研究R．solani的遺傳多樣性．Liu等［9］用11個限制性內(nèi)切酶對161個菌株的18SrRNA區(qū)域進(jìn)行限制性分析，獲得4種圖譜：圖譜I代表大部分R．solani亞群；圖譜II代表2E和9的菌株，與圖譜Ⅰ相比缺少1個限制性位點；圖譜III代表5C菌株，較圖譜I缺少2個限制性位點；圖譜IV有明顯的限制性位點變異，代表10A和B菌株．根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，AG－10與其它融合群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)．Matsumoto等［10］分析了57株菌株28SrDNA的多樣性，結(jié)果顯示AG－1、AG－2和AG－4之間存在多樣性；同時發(fā)現(xiàn)在AG－1亞群中，用HpaII酶切AG－1－IA的rDNA片段模式與AG－1－IB和AG－1－IC有很大的不同．用HhaI和HpaII酶切AG2－1、2－2IIIB和2－2IV，觀察到的片段模式也是不同的．將限制性內(nèi)切酶結(jié)果和聚類分析相結(jié)合，表明AG－1和AG－2的亞群又可細(xì)分成不同的種內(nèi)亞群，這些亞群與其它融合群在親緣關(guān)系上很遠(yuǎn)．

3 討 論

R．solani是一個相當(dāng)復(fù)雜的集合群，已分成14個國際標(biāo)準(zhǔn)融合群，AG1－AG10在形態(tài)、生理、生態(tài)、致病性和寄主等方面均存在一定的遺傳多樣性．最近十幾年來，主要通過同工酶組成、脂肪酸含量以及各種分子標(biāo)記研究該菌的遺傳多樣性．在各種方法中，由于ITS選擇壓力小、進(jìn)化快、有非常豐富的遺傳變異，加之R．solani的rDNA－ITS片段僅611～740bp，片段小易于分析，因此，rDNA－ITS分析已成為R．solani遺傳多樣性的研究中較為常用的方法．

通過直接測序和RFLP分析R．solani的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)融合群又可以分為不同的亞群：Liu等［12］根據(jù)RFLP和同工酶技術(shù)認(rèn)為AG－1可分為6個亞群．Salazar等［39］根據(jù)ITS序列分析認(rèn)為AG－2可分為7個亞群．Liu等［20］根據(jù)rDNA－ITS區(qū)的限制性圖譜認(rèn)為AG－3可分為2個亞群、AG－4可分為2個亞群、AG－5可分為3個亞群，而AG－10可分成2個亞群．這表明即便在相同融合群中也存在著豐富的遺傳多樣性．

由于選擇壓力小，ITS1和ITS2區(qū)域相比于5．8S，18S和28S區(qū)更能累計序列變異．不同融合群的rDNA－ITS區(qū)段在擴(kuò)增片段大小及序列組成上都存在豐富的差異［8，34］．盡管目前紋枯菌的遺傳多樣性主要通過分析ITS1和ITS2區(qū)域而獲得，但也有研究表明18S和28S區(qū)域也可以對部分融合群進(jìn)行亞群區(qū)分［9－10］，這在一定程度上表明即便是進(jìn)化相對保守的區(qū)段在同一融合群內(nèi)同樣能顯現(xiàn)出豐富的變異，利用這些保守的區(qū)段也可以研究紋枯菌的遺傳多樣性，同時也可以幫助理解在這些區(qū)段紋枯菌的進(jìn)化機(jī)制．

依據(jù)DNA在不同濃度變性劑中解鏈動態(tài)不同，變性梯度凝膠電泳（DGGE）可以將相同片段長度但堿基組成不同的DNA片段分開．鑒于RFLP法受制于限制性內(nèi)切酶，而測序法成本高很難實現(xiàn)高通量，DGGE無疑為紋枯菌rDNA－ITS分析提供了新的手段．利用其能夠區(qū)分不同堿基組成片段的特性，可以將同一融合群中rDNA－ITS片段長度一致且只有單核苷酸差異的菌株分開，大大提高了檢測的靈敏度，且周期短可比測序法獲得更快更豐富的數(shù)據(jù)．同時可以選擇性地對差異片段進(jìn)行測序分析，從而降低獲取差異的測序成本．筆者所在實驗室也正在利用DGGE技術(shù)對浙江省不同地區(qū)的水稻紋枯菌進(jìn)行分析，初步結(jié)果表明浙江省水稻紋枯菌呈現(xiàn)豐富的多態(tài)性，對其進(jìn)一步的研究可以更加完善此項實驗技術(shù)并更深入地了解省內(nèi)水稻紋枯菌遺傳多樣性．

［1］Taheri P，Tarighi S．Cytomolecular aspects of rice sheath blight caused byRhizoctoniasolani［J］．European Journal of Plant Pathology，2011，129（4）：511－528．

［2］Anderson N A．The genetic and pathology ofRhizoctoniasolani［J］．Annual Review of Phytopathology，1982，20（1）：329－347．

［3］Ogoshi A．Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific groups ofRhizoctoniasolaniKühn［J］．Annual Review of Phytopathology，1987，25（1）：125－143．

［4］Sneb B，Burpee L，Ogoshi A．Identification ofRhizoctoniaspecies［M］．Santa Paul，Minnesota：The American Phytopathological Society，1991：20－29．

［5］Schultz H．Vergleichende untersuchungen zur?kologie，morphologie und systematik des"vermehrungspilzes"［J］．Arbeiten aus der Biologischen Reichsanstalt fur Land－und Forstunrtschaft，1936，22：1－41．

［6］Cubeta M A，Vilgalys R．Population biology of theRhizoctoniasolanicomplex［J］．Phytopathology，1997，87（4）：480－484．

［7］Carling D E，Kuninaga S，Brainard K A．Hyphal anastomosis reactions，rDNA－internal transcribed spacer sequences，and virulence levels among subsets ofRhizoctoniasolanianastomosis group－2（AG－2）and AG－BI［J］．Phytopathology，2002，92（1）：43－50．

［8］Kuninaga S，Natsuaki T，Takeuchi T，etal．Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups inRhizoctoniasolani［J］．Current Genetics，1997，32（3）：237－243．

［9］Liu Z L，Domier L L，Sinclair J B．Polymorphism of genes coding for nuclear 18SrRNA indicates genetic distinctiveness of anastomosis group 10from other groups in theRhizoctoniasolanispecies complex［J］．Applied and Environmental Microbiology，1995，61（7）：2659－2664．

［10］Matsumoto M，F(xiàn)uruya N，Takanami Y，etal．RFLP analysis of the PCR－amplified 28SrDNA inRhizoctoniasolani［J］．Mycoscience，1996，37（3）：351－356．

［11］Sanger F，Nicklen S，Coulson A R．DNA sequencing with chain－terminating inhibitors［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1977，74（12）：5463－5467．

［12］Liu Z L，Sinclair J B．Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1ofRhizoctoniasolaniusing ribosomal DNA internal transcriber spacer and isozyme comparisons［J］．Canadian Journal of Plant Pathology，1993，15（4）：272－280．

［13］Liu Z L，Sinclair J B．Genetic diversity ofRhizoctiniasolanianastomosis group 2［J］．Phytopathology，1992，82（7）：778－787．

［14］Kanematsu S，Naito S．Genetic characterization ofRhizoctoniasolaniAG－2－3by analyzing restriction fragment length polymorphisms of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacers［J］．Annals of the Phytopathological Society of Japan，1995，61（1）：18－21．

［15］Boysen M，Borja M，Moral C，etal．Identification at strain level ofRhizoctoniasolaniAG4isolates by direct sequence of asymmetric PCR products of the ITS regions［J］．Current Genetics，1996，29（2）：174－181．

［16］White T J，Bruns T，Lee S，etal．Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［J］．PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，1990，18：315－322．

［17］Martin K，Rygiewicz P．Fungal－specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts［J］．BMC Microbiology，2005，5（1）：28．

［18］Gardes M，Bruns T D．ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes－application to the identification of mycorrhizae and rusts［J］．Molecular Ecology，1993，2（2）：113－118．

［19］Rehner S A，Samuels G J．Taxonomy and phylogeny ofGliocladiumanalysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences［J］．Mycological Research，1994，98（6）：625－634．

［20］Liu Z L，Domier L L，Sinclair J B．Isg－specific ribosomal DNA polymorphism of theRhizoctoniasolanispecies complex［J］．Mycologia，1993，85（5）：795－800．

［21］Nicoletti R，Lahoz E，Kanematsu S，etal．Characterization ofRhizoctoniasolaniisolates from tobacco fields related to anastomosis groups 2－1and BI（AG 2－1and AG BI）［J］．Journal of Phytopathology，1999，147（2）：71－77．

［22］Priyatmojo A，Escopalao V E，Tangonan N G，etal．Characterization of a new subgroup ofRhizoctoniasolanianastomosis group I（AG－1－ID），causal agent of a necrotic leaf spot on coffee［J］．Phytopathology，2001，91（11）：1054－1061．

［23］Godoy－Lutz G，Steadman J R，Higgins B，etal．Genetic variation among isolates of the web blight pathogen of common bean based on PCR－RFLP of the ITS－rDNA region［J］．Plant Disease，2003，87（7）：766－771．

［24］Falaha R M，Taheri P，Jafarpour B，etal．Characterizing different taxonomic groups ofRhizoctoniaspp．fungi associated with root and crown rot on sugar beet by analyses of rDNA－ITS and PCR－RFLP［J］．Plant Protection，2010，24（3）：1389．

［25］Pannecoucque J，H?fte M．Detection of rDNA ITS polymorphism inRhizoctoniasolaniAG 2－1isolates［J］．Mycologia，2009，101（1）：26－33．

［26］Sharon M，Kuninaga S，Hyakumachi M，etal．The advancing identification and classification ofRhizoctoniaspp．using molecular and biotechnological methods compared with the classical anastomosis grouping［J］．Mycoscience，2006，47（6）：299－316．

［27］Tamura S．A pathogenic gene in an inherited peroxisome disorder and its cellular dysfunction［J］．Seikagaku，2007，79（4）：329－339．

［28］Nei M，Li W H．Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1979，76（10）：5269－5273．

［29］張傳博，蘇曉慶．rDNA ITS區(qū)間PCR－RFLP在腐霉屬11菌株快速鑒別中的應(yīng)用［J］．貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，30（6）：479－482．

［30］Toda T，Mushika T，Hyakumachi M．Development of specific PCR primers for the detection ofRhizoctoniasolaniAG 2－2LP from the leaf sheaths exhibiting large－patch symptom on zoysia grass［J］．FEMS Microbiology Letters，2004，232（1）：67－74．

［31］王玲，黃雯雯，黃世文，等．浙皖鄂地區(qū)水稻紋枯病菌5個種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］．生態(tài)學(xué)報，2011，30（20）：5439－5447．

［32］Kuninaga S，Carling D E，Takeuchi T，etal．Comparison of rDNA－ITS sequences between potato and tobacco strains inRhizoctonia solaniAG－3［J］．Journal of General Plant Pathology，2000，66（1）：2－11．

［33］Pope E J，Carter D A．Phylogenetic placement and host specificity of mycorrhizal isolates belonging to AG－6and AG－12in theRhizoctoniasolanispecies complex［J］．Mycologia，2001，93（4）：712－719．

［34］Carling D E，Baird R E，Gitaitis R D，etal．Characterization of AG－13，a newly reported anastomosis group ofRhizoctoniasolani［J］．Phytopathology，2002，92（8）：893－899．

［35］Fiers M，Edel－Hermann V，Héraud C，etal．Genetic diversity ofRhizoctoniasolaniassociated with potato tubers in France［J］．Mycologia，2011，103（6）：1230－1244．

［36］Carling D E，Kuninaga S，Brainard K A．Hyphal anastomosis reactions，rDNA－internal transcribed spacer sequences，and virulence levels among subsets ofRhizoctoniasolanianastomosis group－2（AG－2）and AG－BI［J］．Phytopathology，2002，92（1）：43－50．

［37］Lees A K，Cullen D W，Sullivan L，etal．Development of conventional and quantitative real－time PCR assays for the detection and identification ofRhizoctoniasolaniAG－3in potato and soil［J］．Plant Pathology，2000，51（3）：293－302．

［38］Guillemaut C，Edel－Hermann V，Camporota P，etal．Typing of anastomosis groups ofRhizoctoniasolaniby restriction analysis of ribosomal DNA［J］．Canadian Journal of Microbiology，2003，49（9）：556－568．

［39］Salazar O，Julian M C，Rubio V．Primers based on specific rDNA－ITS sequences for PCR detection ofRhizoctoniasolani，R．solaniAG 2subgroups and ecological types，and binucleateRhizoctonia［J］．Mycological Research，2000，104（3）：281－285．