王芳，韓春華，宋振鳳，曲政海

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東青島266000)

呼吸機相關性肺炎患者細菌病原的對比研究

王芳，韓春華，宋振鳳，曲政海

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東青島266000)

目的探討呼吸機相關性肺炎患者細菌病原特點。方法選取確診呼吸機相關性肺炎的患者85例為研究對象，將所獲下呼吸道分泌物為標本，留標本一分為二，一份于30分鐘內行分離培養(yǎng)加藥敏檢測；另一份置-80℃冰箱保存，集中進行多重PCR檢測。采用多重PCR方法檢測5種呼吸機相關性肺炎常見細菌病原菌的陽性率及分布情況。結果常規(guī)分離培養(yǎng)呼吸機相關性肺炎患者檢出21株致病菌，陽性率為24.7%（21/85）,G-菌占85.7%（18/21）；多重PCR檢測呼吸機相關性肺炎患者檢出69株致病菌，陽性率為81.2%（69/85），G-菌占89.9%（62/69）。標本采集前有71.7%（61/85）的患者采用了抗生素治療，分離培養(yǎng)陽性率為11.5%(7/61),多重PCR陽性率為80.3%（49/61）。結論呼吸機相關性肺炎患者下氣道感染病原以革蘭氏陰性菌為主；多重PCR檢測的陽性率高于分離培養(yǎng)，這在已使用抗生素治療的患者中尤為有效，可以作為分離培養(yǎng)的有利補充。

呼吸機相關性肺炎；分離培養(yǎng)；多重PCR；病原菌

呼吸機相關性肺炎(ventilatorassociated pneumonia,VAP)是機械通氣患者最主要的醫(yī)院獲得性感染，也是最常見、最嚴重的醫(yī)院獲得性肺炎，是重癥監(jiān)護室（Intensive Care Uint，ICU）患者的主要死因。據(jù)報道，VAP發(fā)病率國內為6%～52%[1],國外最高達76%[2]，病死率25%～76%[1]?；颊咭坏┌l(fā)生VAP，極易出現(xiàn)脫機困難,造成住院時間延長,住院費用增加，嚴重者危及生命。VAP患者的病原學往往非常復雜，常為混合感染。為有效治療VAP,明確病原是首要問題。本文通過對ICU中VAP患者的下氣道分泌物進行分離培養(yǎng)及多重PCR檢測，了解其細菌病原分布特點，同時評價多重PCR檢測的準確性，探討多重PCR檢測在VAP患者病原診斷中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1臨床資料

1.1試劑與儀器NaOH，注射用滅菌生理鹽水，Tris，EDTA，無水乙醇，Loadingbuffer，蛋白酶K，細菌DNA提取試劑盒等（由寶泰克公司提供，PCR引物，TaqDNA聚合酶等由大連生物公司提供）；低溫離心機，核酸蛋白分析儀由美國Beckman公司提供PCR儀由德國Eppendorf公司提供；凝膠成像儀由德國Albert公司提供。

1.2研究對象選取2012年7月—2013年3月期間我院ICU確診VAP患者85例，其中男52例,女33例,年齡26～81歲,平均46.5歲。選取的患者第一診斷分別為：心力衰竭8例；腎病綜合征合并大量胸腔積液3例；顱內出血10例；溺水2例；急性胰腺炎2例；藥物中毒8例；急性肺損傷6例；肺癌肺葉切除術后5例；腫瘤晚期8例；復合外傷17例；昏迷3例；糖尿病1例；系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例；一氧化碳中毒1例。選取標準符合VAP診斷標準[3]，即：使用機械通氣( MV)48 h后或撤機拔管48 h內X線胸片,出現(xiàn)新的或進行性增大的肺部浸潤性陰影,肺部實變體征和(或)可聞及濕啰音,同時具備下列條件之一：1)外周血白細胞總數(shù)增高(WBC＞10.0×109/L)。2)體溫＞37.5℃。3)呼吸道有膿性分泌物。4)從支氣管分泌物中分離出新的病原菌。

1.3標本采集用一次性無菌吸痰管連接滅菌密閉容器，經(jīng)氣管插管抽吸下氣道分泌物標本共85份。將收集的下氣道分泌物的標本分成2份，一份于30分鐘內送檢驗科細菌室行培養(yǎng)加藥敏檢測；另一份置-80℃冰箱保存，集中行多重PCR檢測。

1.4檢測方法

1.4.1分離培養(yǎng)+藥敏將收集到的下氣道分泌物以無菌接種環(huán)接種到哥倫比亞巧克力平板、哥倫比亞血平板和斯氏平板上，鋪滿90mm平皿，分別放在二氧化碳、有氧及厭氧環(huán)境下生長35℃,18～72 h，每18 h記錄一次，厭氧菌培養(yǎng)采用氣袋法，72 h以后觀察記錄。菌株鑒定及藥敏試驗嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行培養(yǎng)、鑒定，藥敏采用KB紙片擴散法，結果按照美國臨床實驗標準委員會（NCCLS）標準判斷。

1.4.2多重PCR檢測引物的設計：根據(jù)GenBank基因序列已公布的SA Nuc基因、EC 16S-RNA基因、Ab OXA-51基因、KPN 16S-RNA基因、PA gyrb基因間隔區(qū)基因序列，通過分子生物學DNAStar、Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft Inc,Canada)和BLAST軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析后設計5對引物。5種細菌多重PCR引物序列如下：1）鮑氏不動桿菌(Ab)靶基因為OXA-51，引物（5’-3’）為F：CTCGTGCTTCGACCGAGTAT、R：AACCAACACGCTTCACTTCC。2）銅綠假單胞菌(PA)靶基因為Gyrb，引物（5’-3’）為F：CCTGACCATCCGTCGCCACAAC、R：CGAAGCAGGATGCCGACGCC。3）金黃色葡萄球菌（SA）靶基因為Nuc引物（5’-3’）為F：CATTGGTTGACCTTTGTACATTAA、R：GATGGAAAAATGGTAAACGAAG。4）肺炎克雷白桿菌(KPN)靶基因為16S-RNA，引物（5’-3’）為F：ATTTGAAGAGGTTGCAAACGA、R：TTCACTCTGAAGTTTT CTTGTGTT。5）大腸桿菌(EC)靶基因為16S-RNA，F(xiàn)：AATGGCGCATACAAAGAGAAGC、R：GTTGCAGACT CCAATCCGGA。

1.4.3標本的處理及細菌DNA的提取先將標本在室溫下解凍，然后加入4%的NaOH 1～1.5mL靜置15min，將其消化液化；離心10,000 rpm，10min，棄上清；加入無菌生理鹽水1mL，混勻，10,000 rpm離心，5min，棄上清；再次加無菌生理鹽水1mL，混勻，10, 000 rpm，離心5min，棄上清；將所得沉淀物用細菌DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4.4多重PCR檢測確立多重PCR的反應體系為50μL，包括Premix ExTaq 25μL,各引物對（20 uM）各1μL，模板（根據(jù)每個標本DNA濃度的不同，確定其總量），以滅菌蒸餾水補足50μL。以雙蒸水替代DNA作為陰性對照模板，以目標檢測菌株（SA、KPN、EC、Ab、PA）的DNA作為陽性對照模板。反應體系為：94℃預變性10min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。將多重PCR反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，于BIORAD凝膠成像系統(tǒng)下拍攝成像并觀察結果。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料進行χ2檢驗。

2結果

2.1標本分離培養(yǎng)結果21例標本細菌培養(yǎng)陽性，陽性率為24.7%（21/85）。其中金黃色葡萄球菌兩株；鮑氏不動桿菌3株；大腸桿菌6株；銅綠假單胞菌3株；肺炎克雷白桿菌4株；洋蔥伯克霍爾德菌1株；嗜麥芽窄食單孢菌1株；屎腸球菌1株；白假絲酵母菌1株；其中1例患者同時培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌和洋蔥伯克霍爾德菌，兩株金黃色葡萄球菌中1株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

2.2標本多重PCR結果69例標本檢出病原菌，陽性率為81.2%（69/85）。其中，金黃色葡萄球菌10株，鮑氏不動桿菌15株；大腸桿菌20株；銅綠假單胞菌12株；肺炎克雷白桿菌15株。包括3例患者同時檢出2種病原菌：2例同時檢測出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌；1例同時檢測出肺炎克雷白桿菌和金黃色葡萄球菌。

2.3病原菌檢出情況對比本研究中標本多重PCR與標本細菌培養(yǎng)對金黃色葡萄球菌（SA）、鮑氏不動桿菌(Ab)、大腸桿菌（EC）、銅綠假單胞菌(PA)及肺炎克雷白桿菌(KPN)的對比檢出情況見表。其中多重PCR對SA、Ab、EC、PA及KPN的檢出率分別為：11.8%（10/85）；17.6%（15/85）；23.5%(20/85)；14.1% (12/85)；17.6%(15/85)。SA、Ab、EC、PA及KPN細菌培養(yǎng)陽性分別為：2例、3例、6例、3例、4例。多重PCR對SA、Ab、EC、PA及KPN細菌培養(yǎng)陽性比較P均＜0.05。

2.4多重PCR的特異性與敏感性分析多重PCR對五種細菌病原的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值見表1。敏感性=多重PCR與細菌培養(yǎng)檢測共同陽性例數(shù)/細菌培養(yǎng)檢測陽性例數(shù)×100%，特異性=多重PCR與細菌培養(yǎng)檢測共同陰性例數(shù)/細菌培養(yǎng)檢測陰性例數(shù)×100%，陽性預測值=多重PCR與細菌培養(yǎng)檢測共同陽性例數(shù)/多重PCR陽性例數(shù)× 100%，陰性預測值=多重PCR與細菌培養(yǎng)檢測共同陰性例數(shù)/多重PCR陰性例數(shù)×100%。

表1 多重PCR檢測標本中五種病原體的敏感性與特異性分析（例,%）

2.5抗生素的應用對檢出率的影響留取標本前使用過抗生素的61例（71.8%）患者，標本分離培養(yǎng)檢出7株致病菌，其中銅綠假單胞菌1例（1.6%）、大腸桿菌3例（4.9%）、肺炎克雷伯桿菌2例（3.3%）及白假絲酵母菌1例（1.6%）；多重PCR檢出49株致病菌，其中金黃色葡萄球菌5例（8.2%）、鮑氏不動桿菌9例（14.8%）、銅綠假單胞菌9例（14.8%）、大腸桿菌14例（23.0%）及肺炎克雷伯菌桿菌12例（19.7%）。多重PCR與分離培養(yǎng)比較P＜0.01。

3討論

目前報道有關VAP患者的病原學檢查主要以培養(yǎng)為主，通常耗時至少3 d左右，且操作繁瑣、所受影響因素多，尤其受早期應用抗菌藥物影響較大。近年來，隨著分子生物學迅速發(fā)展，在分子及基因水平上診斷致病菌，已成為病原學診斷的研究熱點。常用的分子生物學方法有PCR、探針雜交法和單鏈構象多態(tài)性等。其中PCR方法從DNA提取到獲取結果所需時間不到2 h，與傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)方法相比具有極大的優(yōu)勢，對早期明確病原菌十分重要。普通PCR只是針對一種病原菌的檢測方法，而多重PCR技術可利用較少的試驗成本同時檢測多個核酸樣本，同時可大大的節(jié)省檢測時間和經(jīng)費開支。

對VAP患者下氣道分泌物行分離培養(yǎng)的同時對同一標本進行多重PCR檢測，結果顯示病原菌均以革蘭氏陰性菌為主，這也與國內外許多學者得到的結果相同[4-5]。選取了大腸桿菌（EC）、銅綠假單胞菌(PA)、肺炎克雷白桿菌(KPN)、金黃色葡萄球菌（SA）及鮑氏不動桿菌(Ab)做為檢測菌株，主要是結合前期分離培養(yǎng)結果與已報道的VAP患者的常見病原譜[4-5]，同時這也與研究中標本的細菌培養(yǎng)結果相符。多重PCR較傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)在VAP患者下氣道分泌物大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷白桿菌、鮑氏不動桿菌及金黃色葡萄球菌的檢出方面的有顯著性差異，提示多重PCR在以上病原菌的檢查方面較細菌培養(yǎng)具有優(yōu)勢；同時多重PCR技術在檢測以上各病原菌的敏感性均為100%，即傳統(tǒng)分離培養(yǎng)獲取的病原菌通過多重PCR技術完全可以檢出，這也提示多重PCR在檢測VAP患者下氣道分泌物病原菌方面具有一定的可信度。

對于一種新的診斷方法來說，最大難題是與常規(guī)的傳統(tǒng)方法相比較，如何評價其敏感性。本研究證實多重PCR對金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌及銅綠假單胞菌的診斷的敏感性均可達100%，且對五種病菌檢測的特異性均較高。另外，疾病發(fā)生率的高低對其預測值的大小起決定性作用。由于本研究中的5種病原體是引起VAP感染最常見的病原菌，加上多重PCR具有很高的陰性預測值，這也與國外相關報道相一致[6]，而多重PCR陰性結果的價值在于可以在臨床上早期用于排除這些病原體。

在樣本采集前有71.7%的患者采用了抗生素治療。已應用抗生素治療的患者的下氣道分泌物多重PCR檢測與標本細菌培養(yǎng)相比，多重PCR具有更高的檢出率。因此，當已應用抗生素治療的患者的標本細菌培養(yǎng)物出現(xiàn)假陰性結果時可以用多重PCR進一步檢測。另外，研究中由于大量患者標本采集前已使用過抗生素治療，金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌等作為VAP感染的標本細菌培養(yǎng)病原學診斷率很低，同時在檢測已應用抗生素治療的患者的病原菌陽性例數(shù)方面，多重PCR檢測與傳統(tǒng)的標本細菌培養(yǎng)相比差異具有統(tǒng)計學意義，這都證明多重PCR能很好的指導相關治療[7]。

盡管如此，多重PCR在實際應用中也存在一定不足。PCR有較高的靈敏度，操作過程必須嚴格實驗步驟，稍有污染就會造成假陽性；多對引物同時擴增，各種實驗條件如果控制不當，很容易導致擴增的失敗或產生非特異性產物[8]；且引物的設計、靶序列的選擇不當都可能降低其靈敏度和特異性。此外雖然一次多重PCR中實現(xiàn)多次的常規(guī)PCR，理論上引物對的數(shù)量不限，但目前的研究受到檢測病原菌種類、模板的類型及實驗儀器等多種因素限制，備檢病原菌無法做到無限制的增加，目前可檢索到病原體種類仍有限。另外多重PCR技術仍不能做到像傳統(tǒng)分離培養(yǎng)一樣作出藥敏診斷且不同的DNA提取方法也可能使反應結果有所不同[9]。

多重PCR檢測技術具有無可比擬的優(yōu)越性，大量的單個技術已改為多重擴增來進行遺傳代謝性疾病和感染性疾病的診斷，其在科研和臨床領域都將會有更好的應用。隨著多重PCR方法在感染性疾病病原診斷中的應用，我們希望越來越多的VAP患者能盡早確定病原菌，盡早治療，以期待減少VAP的病死率。

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Con trastive Study of Pathogens in Patien tsw ith Ven tilator-associated Pneum onia

W ang Fang，Han Chunhua，Song Zhenfeng，Qu Zhenghai
（Affiliated HospitalofQingdao University MedicalCollege,Qing dao 266000,Shandong）

ObjectiveIn order to study the pathogen distribution of lower respiratory tractof adult ICU ventilatorassociated pneumonia（VAP）patients and discuss the diagnostic value ofmultiplex PCR in bacterial pathogens of VAP patients,secretion of lower respiratotractwas isolated and detected bymultiplex PCR.Methods85 samples of lower respiratory tract secretion from diagnosed VAP patients in ICU ward were collected,and each sample was divided to two,so all the sampleswere seperated into two parts.One partwere sent to laboratory room to isolate and culture bacteria and test drug sensitivity in 30m inutes.Another part sampleswere saved in-80℃refrigerator,and then were tested by multiplex PCR.The positive rate and the distribution of 5 kinds of common bacterial pathogens(Staphylococcus aureus, Escherichia coli,K lebsiella pneumoniae,Pseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumannii)in VAPwere analyzed.Resu lts Conventional isolation and culturewere used,and 21 strains of pathogenic bacteriawere detected in VAP patients. The positive ratewas 24.7%(21/85),and Gram-negtive bacteria positive ratewas 85.7%(18/21).69 strains of pathogenic bacteriawere detected positive in VAP patients usingmultiplex PCR.The positive rate was 81.2%（69/85）,and Gramnegtive bacteria positive rate was 89.9%(62/69).71.7%(61/85)patients w ith VAP were treated w ith antibiotics before sample collection,the positive rate of isolation and culture was 11.5%(7/61),while the positive rate ofmulti plex PCR was 80.3%(49/61).Conclusions Both bacteria culture andmultiplex PCR detection secretions of VAP patients lower respiratory tractaremainly gram-negtive bacteria,and the pathogenic bacteria positive rate ofmultiplex PCR is higher than thatof isolation and culture,especially in the pretreated w ith antibiotics.Therefore,multiplex PCR can be used as the supplementof isolation and culture.

v entilatorassociated pneumonia(VAP);isolation and culture;multiplex PCR;pathogenic bacteria

R563.11

：A

：1008-4118（2013）03-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.03.01

2013-06-

王芳(1982-)，女，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，工作單位：青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院黃島分院兒科。

曲政海，男,quzhenghai@163.com。