盧 楠，馮惠勇，王立暉

（1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系，河北石家莊 050026；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；3.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工系，天津 300222）

糖苷酶是一大類催化糖苷鍵水解的酶，在國(guó)際酶學(xué)命名方法中歸位序EC 3.2.1，是目前用于酶法合成糖苷和低聚糖的一類重要的酶類。特別是某些種類的酶對(duì)乳糖有較高水解活性，在水解乳糖分子中β－1，4－半乳糖苷鍵的同時(shí)，具有轉(zhuǎn)半乳糖基作用，以乳糖或其水解產(chǎn)物半乳糖和葡萄糖為糖基受體合成半乳糖苷鍵，生成低聚半乳糖（galacto－oligosaccharides，GOS）［1－10］。

本研究室構(gòu)建保藏的基因工程菌株產(chǎn)生的耐高溫β－糖苷酶ttβGLY具有較高的乳糖水解活性和轉(zhuǎn)糖基活性，它的耐熱性能有利于酶的分離純化，可在高溫體系中反應(yīng)，具有反應(yīng)速度快、轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，在應(yīng)用上有更大優(yōu)越性。

筆者對(duì)本研究室構(gòu)建保藏的產(chǎn)耐高溫β－糖苷酶重組大腸桿菌的培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了探討，為大幅度提高β－糖苷酶發(fā)酵產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)酶菌株重組大腸桿菌，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建菌種。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨，酵母粉，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘油，尿素，氯化鈉，皆為分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠提供；氨芐青霉素，北京鼎國(guó)生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供；葡萄糖試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；乳清，自制；玉米漿，石藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司提供；其他試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.1.3 主要儀器

HH.BⅡ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠提供；TGL－16C型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠提供；SW－CY－2FD型潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠提供；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，上海雷勃分析儀器有限公司提供；HYG－ⅡB型生物反應(yīng)搖瓶柜，上海欣蕊有限公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基:酵母粉（5g/L）、蛋白胨（10g/L）、氯化鈉（10g/L），pH值調(diào)至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

種子培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，葡萄糖、碳酸鈣按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案加入，pH值調(diào)至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基:氯化鈉（10g/L），碳源、氮源及其他成分按實(shí)驗(yàn)方案加入，pH值調(diào)至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):從斜面種子中取一環(huán)菌接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為37℃，培養(yǎng)12h。

發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照5%的接種量，接種至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為37℃，培養(yǎng)24h。

每批實(shí)驗(yàn)都安排3組平行對(duì)照樣，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值進(jìn)行分析和計(jì)算。

1.2.2 菌體量的測(cè)定

采用菌體干重法:發(fā)酵結(jié)束后，取適量菌液離心，棄去上清液，用蒸餾水洗滌后，將濕菌體放入烘干箱，于60℃下烘至恒重后測(cè)定菌體干重。

1.2.3 酶活的測(cè)定

酶活單位:以乳糖為底物，在溫度70℃、pH值為7.0的條件下，將1min水解產(chǎn)生1mol葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位（U）。

葡萄糖含量測(cè)定:采用葡萄糖氧化酶試劑盒法。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定重組大腸桿菌的搖瓶生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，見圖1。由圖1可以看出:酶活和菌體均在培養(yǎng)時(shí)間為21～24h時(shí)達(dá)到較高，24h后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)酶量并沒有進(jìn)一步提高，因此確定24h為適宜的培養(yǎng)時(shí)間。由pH值變化曲線可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中pH值從初始的7.0一直上升至8.6。這是由于LB培養(yǎng)基中含有大量氮源，而缺少碳源。碳氮比例的不均衡影響菌體的正常生長(zhǎng)和酶活的表達(dá)，因此要以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同的碳源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 菌體在LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線Fig.1 Growth curve andβ－glucosidase production curve on LB medium

2.2 種子工藝的優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖加量的確定

初始培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，鑒于葡萄糖為快速利用的碳源，有利于菌體的生長(zhǎng)，此實(shí)驗(yàn)主要考察培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～1.0%對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，并進(jìn)行工藝優(yōu)化。培養(yǎng)時(shí)間為12h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of different glucose amount in seed medium on cell growth

由表1結(jié)果可知，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的菌體干重最高。但當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～1.0%時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后pH值均低于7.0，而大腸桿菌的生長(zhǎng)最適宜pH值為7.0，所以此時(shí)菌體生長(zhǎng)受到抑制。

2.2.2 碳酸鈣加量的確定

碳酸鈣對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的pH值具有緩沖作用。為了減少種子培養(yǎng)過(guò)程中pH值大幅度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)的不利影響，本實(shí)驗(yàn)考察了葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，添加碳酸鈣對(duì)pH值和菌體生長(zhǎng)情況的影響。結(jié)果見表2。

表2 種子培養(yǎng)基中碳酸鈣加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of different CaCO3amount in seed medium on cell growth

由表2結(jié)果可知，加入0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的碳酸鈣后發(fā)酵液pH值變化幅度減小，更接近大腸桿菌生長(zhǎng)的最適宜pH值。從菌體干重可看出，加入0.5%碳酸鈣的菌體生長(zhǎng)量更高。

2.2.3 種齡的確定

種齡在發(fā)酵過(guò)程中是一個(gè)重要影響因素。種齡短，種子啟動(dòng)慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)；種齡長(zhǎng)，菌種老化，代謝能力減弱。種齡一般選擇在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期，本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)種子生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，確定種子培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌體干重在0～12h上升較快，之后變化較平緩，因此在優(yōu)化后種子培養(yǎng)基條件下，選擇12h為適宜的種子培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源的選擇

LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要成分為酵母浸粉、蛋白胨，含有豐富的氮源，但由于缺少適宜的碳源，因而在發(fā)酵過(guò)程中pH值持續(xù)上升，影響菌體的正常生長(zhǎng)和酶活的表達(dá)。碳源物質(zhì)不僅能促進(jìn)重組菌的生長(zhǎng)，而且對(duì)外源基因的表達(dá)有密切的影響。以LB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加常用的5種碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中乳清添加量以實(shí)際含乳糖的量折合計(jì)算。結(jié)果見表3。

圖2 菌體在優(yōu)化后種子培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve on optimization of seed medium

表3 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.3 Effect of different carbon substrates on cell growth andβ－glucosidase production

由表3可知:以葡萄糖、蔗糖、甘油為碳源，干重、酶活比基礎(chǔ)培養(yǎng)基均略有增長(zhǎng)，但是pH值較低，pH值下降過(guò)快不利于酶活的表達(dá)和活性的保持；以乳糖、乳清為碳源，對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活表達(dá)均有促進(jìn)作用，干重和酶活增長(zhǎng)較大，pH值變化較小，接近中性；乳糖、乳清添加量從1%增加到2%，菌體干重并沒有明顯變化，酶活反而降低。因此，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和產(chǎn)酶情況，選擇乳糖和乳清以1%添加量作為碳源進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 氮源的選擇

以6種氮源分別代替初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的酵母粉和蛋白胨進(jìn)行氮源單因素實(shí)驗(yàn)（分別以1%的乳糖和乳清為碳源），氮源添加量以氮源物質(zhì)的量相等為依據(jù)。結(jié)果見表4。

表4 氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.4 Effect of different nitrogen substrates on cell growth andβ－glucosidase production

由表4可知:以乳糖和乳清為碳源的實(shí)驗(yàn)中，采用無(wú)機(jī)氮源時(shí)菌體量和酶活均低于以蛋白胨、酵母粉作氮源的結(jié)果；玉米漿為氮源時(shí)，酶活較高，但玉米漿中含有大量渣子、色素類物質(zhì)，測(cè)得干重為16.44g/L，無(wú)法準(zhǔn)確得出菌體的真正干重，且玉米漿作氮源發(fā)酵所制酶液由于含有色素類物質(zhì)而導(dǎo)致固定化酶活較低。綜合考慮，選用蛋白胨和酵母粉作為氮源。

分別以1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的乳糖和乳清為碳源，以蛋白胨和酵母粉為氮源，改變蛋白胨和酵母粉的量，以確定合適的添加量。結(jié)果見表5。

由表5可知，以1%乳糖作為碳源，蛋白胨、酵母粉用量逐級(jí)增加，菌體干重隨之增長(zhǎng)，但增至蛋白胨1.2%、酵母粉0.6%后繼續(xù)增加氮源酶活基本不變。以乳清作為碳源，蛋白胨、酵母粉用量逐級(jí)增加，菌體干重隨之增長(zhǎng)，蛋白胨1.4%、酵母粉0.7%后繼續(xù)增加氮源酶活基本不變。考慮綜合因素，分別選擇碳源為1%乳糖，氮源為蛋白胨1.2%、酵母粉0.6%，記為L(zhǎng)1培養(yǎng)基；碳源為1%乳清，氮源為蛋白胨1.4%、酵母粉0.7%，記為L(zhǎng)2培養(yǎng)基。

2.3.3 無(wú)機(jī)鹽配方優(yōu)化

微生物要維持正常的生長(zhǎng)代謝，除需要碳源和氮源外還需要Ca2＋，Mg2＋，K＋等營(yíng)養(yǎng)元素，這些元素將參與細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)必須以無(wú)機(jī)鹽的形式加入各種必需離子。加入濃度過(guò)低，菌體生長(zhǎng)緩慢；加入濃度過(guò)高，反而會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，因此必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出其合適的濃度范圍。

表5 氮源添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.5 Effect of different nitrogen substrates amount on cell growth andβ－glucosidase production

常用無(wú)機(jī)鹽有MgSO4·7H2O，MnSO4，KH2PO4，K2HPO4，KCl等。在L1和L2培養(yǎng)基中，分別添加KH2PO4和K2HPO4，考察磷水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見表6。

表6 磷添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.6 Effect of different P amount on cell growth andβ－glucosidase production

由表6可知，L1和L2培養(yǎng)基添加磷鹽量配比為KH2PO40.30%，K2HPO40.50%時(shí)有利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，把此配方培養(yǎng)基分別記為L(zhǎng)3和L4培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化。

在L3和L4培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O，考察Mg2＋水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見表7。

表7 Mg2＋添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.7 Effect of different Mg2＋amount on cell growth andβ－glucosidase production

由表7可知，L3和L4培養(yǎng)基添加MgSO4· 7H2O為0.10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)有利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，把此配方培養(yǎng)基分別記為L(zhǎng)5和L6培養(yǎng)基。

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件是影響重組菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的重要因素，以上述優(yōu)化結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)菌體產(chǎn)酶條件的影響因素進(jìn)行考察，結(jié)果見表8。

表8 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.8 Effect of different inoculum volume on cell growth andβ－glucosidase production

接種量的大小會(huì)直接影響發(fā)酵周期。接種量過(guò)小，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，增加成本；接種量過(guò)大，培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分消耗快，不利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。由表8可知，接種量為8%時(shí)，L5和L6培養(yǎng)基發(fā)酵的菌體干重和酶活均達(dá)到最高值，故選擇8%為最適宜接種量。

在控制通氣條件時(shí)必須考慮到既要滿足菌體生長(zhǎng)與胞內(nèi)酶合成的不同需求，又要考慮節(jié)省能源，提高經(jīng)濟(jì)效益。在搖瓶培養(yǎng)條件下，可以通過(guò)改變搖床轉(zhuǎn)速或者裝液量來(lái)調(diào)節(jié)通氣量。本研究固定的搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，通過(guò)改變?nèi)瞧垦b液量來(lái)進(jìn)行調(diào)解氧氣的供應(yīng)量，保持其他培養(yǎng)條件相同，在250 mL三角瓶中進(jìn)行24h發(fā)酵，結(jié)果見表9。

表9 搖瓶裝量對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Tab.9 Effect of different amount of shaking flask on cell growth andβ－glucosidase production

由表9可以看出，當(dāng)溶氧水平為250mL三角瓶中裝液體培養(yǎng)基為40mL時(shí)，酶活最高。

3 結(jié) 論

對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定出適合工程菌生長(zhǎng)和耐高溫β－糖苷酶表達(dá)的培養(yǎng)基配方:蛋白胨12g/L，酵母粉6g/L，乳糖10g/L，NaCl 10g/L，KH2PO43g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L?；虿捎萌榍鍨樘荚矗囵B(yǎng)基組成為蛋白胨14g/L，酵母粉7g/L，乳清13.3g/L，NaCl 10g/L，KH2PO43g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L，NaCl 10g/L，CaCO35g/L，種齡12h，接種量為8%，裝量40mL/250mL三角瓶，于37℃發(fā)酵24h。優(yōu)化后以乳糖為碳源，菌體干重、酶活最高可達(dá)6.830g/L和2.016U/mL，分別是優(yōu)化前的3倍和2倍；以乳清為碳源，菌體干重、酶活最高可達(dá)10.010g/L和2.384U/mL，分別是優(yōu)化前的4.4倍和2.4倍。

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