周 麗 谷 云 王清章 湯少華 劉 松 李 潔 嚴(yán)守雷

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

酶促褐變是果蔬采后貯藏加工過程中引起營養(yǎng)價值、外觀品質(zhì)等降低的主要原因之一，直接導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失。果蔬加工過程中，其內(nèi)部的多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶(PPO)的催化下氧化生成醌類化合物，該化合物進(jìn)一步聚合形成復(fù)雜的黑色聚合物，從而導(dǎo)致果蔬制品的褐變[1]。酶促褐變需要3個條件，它們是酶、底物和受氫體氧。控制3個條件中的任意一個因素或幾個因素便能夠達(dá)到控制果蔬酶促褐變發(fā)生的目的。在加工等生產(chǎn)實踐中，底物和氧一般不容易除去。在這種情況下抑制導(dǎo)致酶促褐變的多酚氧化酶的活性成為加工過程中控制酶促褐變的極其重要的方法[2]。抑制果蔬酶促褐變的化學(xué)方法主要是用褐變抑制劑進(jìn)行處理，常用的抑制劑有:亞硫酸鹽、抗壞血酸、半胱氨酸、檸檬酸等[3]。近年來，隨著人們對食品安全的重視，合成的食品添加劑越來越受到市場的限制，消費者對用天然物質(zhì)代替合成化學(xué)物質(zhì)作為食品添加成分的呼聲越來越高[4－5]。近年來，人們在開發(fā)安全有效的天然抗褐變抑制劑方面做出了很多努力，比如:蜂蜜、洋蔥提取液、石榴籽提取液、柿子葉提取液等等[6－7]。

馬鈴薯(Solanum tuberosum)，是茄科茄屬多年生塊莖草本植物。它具有很高的營養(yǎng)價值、保健功能，素有“地下蘋果”和“第二面包”之稱[8]。馬鈴薯是糧食和蔬菜兼用作物之一，其在加工、運輸和銷售過程中極易發(fā)生褐變，因此，以馬鈴薯作為抗褐變研究的對象具有典型意義。徐涵等[9]研究了豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯漿液的抗褐變作用，發(fā)現(xiàn)豌豆酸漿具有顯著的抗褐變效果，但其抑制褐變的成分和機理尚未報道。本試驗對豌豆發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，并通以其對馬鈴薯PPO的抑制效果作為評價指標(biāo)對其抗褐變成分進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯、豌豆:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。

蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶:阿拉丁試劑公司。

鄰苯二酚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、抗壞血酸、L－半胱氨酸、EDTA －Na2、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑:均為分析純，國藥上海試劑公司。

透析袋:美國光譜醫(yī)學(xué)。

722N型可見光分光光度計:上海光譜儀器有限公司；高速冷凍離心機:美國Backman公司；生化培養(yǎng)箱:上海一恒儀器有限公司；恒溫水浴鍋:北京東方精瑞科技公司；AL204分析天平:海梅特勒—托斯多儀器有限公司；豆?jié){機:日本松下電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豌豆發(fā)酵液的制備

參照徐涵等[9]的方法并加以改進(jìn)，豌豆用清水浸泡24 h，加8倍水勻漿、過濾、沉淀，將濾液裝入三角瓶密封，在恒溫培養(yǎng)箱中(20℃)自然發(fā)酵72 h，即得豌豆發(fā)酵液，取上清液在12 000×g離心20 min后備用。豌豆發(fā)酵液的濃度以最終溶液中干豌豆的質(zhì)量濃度計，單位為mg/mL。

1.2.2 馬鈴薯多酚氧化酶(PPO)的提取

馬鈴薯多酚氧化酶的提取參照Sun等[10]的方法并略作修改，馬鈴薯遇冷去皮，加入含有 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)、1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1%TritonX－100的提取液，料液比1∶2，冰浴研磨勻漿，抽濾后濾液于12 000×g離心 15 min。上清液用30%～80%的飽和硫酸銨鹽析，12 000×g離心15 min，收集沉淀，將沉淀溶于少量0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液中(pH 6.8)，用同樣的緩沖液透析過夜，得到PPO粗提液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同抑制劑對馬鈴薯PPO抑制率的測定

將一定濃度的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA－Na2、未發(fā)酵豌豆液和豌豆發(fā)酵液分別與馬鈴薯多酚氧化酶混合并進(jìn)行酶活測定。測定方法參照Lee等[11]的方法略作修改，取 1mL pH 6.8的0.01mol/L磷酸鈉緩沖液加入1 mL抑制劑和0.1 mL PPO粗酶液在37℃保溫3 min后，加0.9 mL 20 mmol/L鄰苯二酚(用 0.01 mol/L，pH 6.8磷酸鈉緩沖液配制)迅速混勻，立刻測定 OD410值的變化，以每分鐘ΔOD410變化0.001表示一個酶活力單位。以未加抑制劑的處理作為空白，PPO抑制率計算如下式:

1.2.4 化學(xué)成分預(yù)試

按照植物化學(xué)成分系統(tǒng)分析的常規(guī)方法，直接對豌豆發(fā)酵液和未發(fā)酵的豌豆液檢測以及采用正丁醇、石油醚等極性不同的溶劑分別對發(fā)酵液進(jìn)行萃取，制成相應(yīng)的供試液，并采用試管法和圓形濾紙層析法進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)試驗[12－13]

1.2.5 熱處理對發(fā)酵液抗褐變活性的影響

將豌豆發(fā)酵液分別經(jīng)40、60、80、100、121℃處理30 min和60 min，冷卻后10 000×g離心 15 min，取上清液測定其對PPO酶活的抑制效果。以經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾的樣品為對照。每處理重復(fù)3次。

1.2.6 pH對發(fā)酵液抗褐變活性的影響

將豌豆發(fā)酵液的 pH分別調(diào)至 2、4、6、8、10、12后靜置30 min，再將各處理組的pH調(diào)回初始發(fā)酵液的pH，分別測定各處理組對PPO酶活的抑制效果，以未經(jīng)酸堿調(diào)節(jié)的豌豆發(fā)酵液作為對照。每處理重復(fù)3次。

1.2.7 發(fā)酵液中馬鈴薯抗褐變成分的分子質(zhì)量預(yù)估

采用4種規(guī)格的透析袋:8 000 u、3 500 u、1 000 u、500 u。分別取10 mL豌豆發(fā)酵液置于透析袋內(nèi)，在4℃條件下，用蒸餾水透析24 h，每6～8 h更換1次水，收集合并所有更換下來的水，真空減壓濃縮至10 mL，稱為滲出液。取出透析袋內(nèi)的發(fā)酵液分別補足至10 mL，稱為透析液。測定經(jīng)不同規(guī)格透析袋處理后的透析液和滲出液對PPO的抑制效果，以透析前的豌豆發(fā)酵液作為對照。每處理重復(fù)3次。

1.2.8 不同極性有機溶劑萃取后發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制效果

取豌豆發(fā)酵液200 mL，以4倍量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取 3次，時間分別為 4、2、2 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得到總浸膏。浸膏用水分散，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分別對各相進(jìn)行減壓蒸餾至無有機試劑味，測定每一部分樣品對馬鈴薯PPO的抑制效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆發(fā)酵液與常用褐變抑制劑對馬鈴薯PPO抑制效果的比較

測定了低、中、高3個濃度下豌豆發(fā)酵液和未發(fā)酵豌豆液對馬鈴薯PPO的抑制活性，并且與亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、檸檬酸和EDTA－Na24種常用褐變抑制劑的作用效果進(jìn)行了比較。結(jié)果見表1。

表1 豌豆發(fā)酵液與常用褐變抑制劑對馬鈴薯PPO的抑制效果比較

由表1可以看出，亞硫酸氫鈉和抗壞血酸對馬鈴薯PPO的抑制效果最明顯，而檸檬酸和EDTA－Na2的抑制效果較差。濃度為90 mg/mL的豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制率達(dá)到了100%，與0.2 mg/mL的亞硫酸氫鈉、0.4 mg/mL的抗壞血酸的抑制效果相當(dāng)。豌豆發(fā)酵液的濃度越大，其對馬鈴薯PPO的抑制效果越好，這一結(jié)果與徐涵等[9]的研究一致。120 mg/mL的未發(fā)酵豌豆液對馬鈴薯PPO的抑制率也達(dá)到了68.63%，說明豌豆?jié){液本身具有抗褐變效果，但其效果沒有發(fā)酵后的豌豆?jié){液好，這可能跟發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生的許多小分子代謝物質(zhì)，包括酸、乙醇、丁二酮、H2O2和其他代謝產(chǎn)物，具有較強的絡(luò)合金屬離子能力和較高的抗氧化性，能有效抑制酶促褐變有關(guān)[14]。這也說明了豌豆發(fā)酵液中的抗褐變成分可能不是單一組分，而是幾種成分的協(xié)同作用。

2.2 豌豆酸漿發(fā)酵液化學(xué)成分預(yù)試結(jié)果

采用試管法和圓形濾紙層析法對發(fā)酵液發(fā)酵前后的化學(xué)成分進(jìn)行了預(yù)試，見表2。結(jié)果表明 ，從化學(xué)成分看發(fā)酵液發(fā)酵前后都含有氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、有機酸、多酚類、黃酮類、內(nèi)酯類，而發(fā)酵后的酵液中未檢出生物堿、油脂、甾體、萜類等物質(zhì)。這說明豌豆發(fā)酵液中的有效抗褐變成分不是生物堿、油脂、甾體、萜類物質(zhì)，可能是氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、有機酸、多酚類、黃酮類中的一種或幾種。

2.3 熱處理對發(fā)酵液抗褐變活性的影響

豌豆發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度，不同時間處理后對馬鈴薯PPO的活性抑制情況見圖1。

圖1 豌豆發(fā)酵液的熱處理對馬鈴薯PPO抑制作用的影響

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，豌豆發(fā)酵液在室溫、40、60、80、100℃分別處理30 min和60 min后，各處理在5%顯著性水平上差異不顯著(P＞0.05)。0.1 MPa滅菌30 min和60 min后，豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制活性分別下降了5.32%和9.62%。說明了豌豆發(fā)酵液中的褐變抑制成分是一種或幾種對熱穩(wěn)定的物質(zhì)。此外，由于熱處理可以使蛋白質(zhì)變性，此結(jié)果也間接說明了豌豆發(fā)酵液中抗褐變成分不是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

表2 豌豆酸漿粗發(fā)酵液成分預(yù)試結(jié)果

2.4 pH對發(fā)酵液抗褐變活性的影響

發(fā)酵液在不同pH條件下處理30 min后測定各處理組對馬鈴薯PPO的抑制效果，以未經(jīng)酸堿處理的試樣作為對照，結(jié)果見圖2。

圖2 豌豆發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性測試結(jié)果

由圖2可知，豌豆發(fā)酵液經(jīng)酸堿調(diào)節(jié)后，未調(diào)回原pH 3.95的情況下，在pH 2時對PPO的抑制率達(dá)到了85%，而在pH 4～10時，隨著pH的升高對PPO的抑制率下降，在pH 12時，對PPO的抑制率又有所增加。出現(xiàn)這種情況的原因可能是在強酸強堿環(huán)境下，PPO本身沒有處于最適 pH范圍(pH 5～8)[15]有關(guān)，由于這種情況的干擾，此方法不能科學(xué)的反應(yīng)豌豆發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性。因此改進(jìn)方法如下:將豌豆發(fā)酵液經(jīng)酸堿調(diào)節(jié)后，放置30 min，再將各處理調(diào)回原pH 3.95進(jìn)行抗褐變效果的測定，結(jié)果表明，豌豆發(fā)酵液經(jīng)強酸強堿處理后，對PPO的抑制活性經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，并無顯著性差異(P＞0.05)，說明褐變抑制成分沒有受到強酸強堿破壞，其酸堿穩(wěn)定性較好。

2.5 發(fā)酵液中抗褐變成分的分子質(zhì)量預(yù)估

將豌豆發(fā)酵液用不同規(guī)格的透析袋進(jìn)行透析處理，并測定了處理后的發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制效果，結(jié)果見圖3。

圖3 豌豆發(fā)酵液經(jīng)不同截留分子量透析后各部分對馬鈴薯PPO的抑制作用

由圖3可知，豌豆發(fā)酵液經(jīng)截留分子量分別為8 000、3 500和1 000 u的透析袋透析處理后，透析液對馬鈴薯PPO的抑制效果均在10%以下，而滲出液對馬鈴薯PPO的抑制效果均達(dá)到了80%以上，另外，考慮到透析不完全等因素也會導(dǎo)致部分有效成分不能完全被透析出來，因此，可以初步認(rèn)定豌豆發(fā)酵液的抗褐變成分的分子質(zhì)量在1 000 u以下。豌豆發(fā)酵液經(jīng)截留分子質(zhì)量為500 u的透析袋處理后，透析液對馬鈴薯PPO的抑制率僅為21.21%，而滲出液對馬鈴薯PPO的抑制率也只有48.57%，由于考慮到透析不完全等因素，目前還不能得出豌豆發(fā)酵液抗褐變成分的分子質(zhì)量在500 u以下的結(jié)論，結(jié)果有待進(jìn)一步試驗。綜合以上分析可以初步推斷，豌豆發(fā)酵液的抗褐變成分為小分子物質(zhì)，可以排除蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)。

2.6 不同極性有機溶劑萃取后發(fā)酵液的抗褐變效果

測定了不同極性有機溶劑萃取后的豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制效果，結(jié)果見圖4。

圖4 豌豆發(fā)酵液經(jīng)萃取后各萃取段對馬鈴薯PPO的抑制作用

由圖4可知豌豆發(fā)酵液經(jīng)95%乙醇除雜，濃縮后，再依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分段，將經(jīng)真空濃縮除去有機試劑后的各部分再用氮氣吹去殘余試劑，最后分別定容到初始體積，測定各部分對馬鈴薯PPO的抑制效果。結(jié)果表明，水相對馬鈴薯PPO的抑制作用最顯著，抑制率為37.59%；其次是乙酸乙酯相，抑制率為30.9%；正丁醇相的抑制率為16.13%；石油醚相濃縮到10 mL后對馬鈴薯PPO的抑制率僅為2.26%，幾乎沒有抑制效果。根據(jù)相似相容原理可以判定，豌豆發(fā)酵液中的抗褐變因子很可能是一種或幾種極性較大的物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外對抑制果蔬褐變的研究很多，主要采用化學(xué)抑制劑抑制果蔬加工過程中的酶促褐變。本試驗研究了天然豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制作用，并對豌豆發(fā)酵液中的抗褐變成分進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明:(1)豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO有很強的抑制效果，90 mg/mL的豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制率達(dá)到了100%，其對馬鈴薯PPO的抑制效果與0.04mg/mL的亞硫酸氫鈉、抗壞血酸相當(dāng)，比0.08 mg/mL的檸檬酸和EDTA－Na2的效果好。(2)采用試管法和圓形濾紙層析法對發(fā)酵液進(jìn)行了化學(xué)成分的分析，豌豆發(fā)酵液中主要含有:氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、有機酸、多酚類、黃酮類、內(nèi)酯類等物質(zhì)。(3)豌豆發(fā)酵液的抗褐變成分具有良好的熱穩(wěn)定性和較廣的pH耐受范圍，在pH 2～12的范圍內(nèi)能較好的保持其抗褐變活性。100℃以下不同溫度處理30 min后發(fā)酵液對馬鈴薯PPO的抑制活性跟處理前相比沒有顯著的差異。(4)發(fā)酵液中的，有效抗褐變成分為分子質(zhì)量小于1 000 u的極性較大的小分子物質(zhì)。綜上所述，豌豆發(fā)酵液的抗褐變成分可能是有機酸、多酚和黃酮類物質(zhì)中的一種或幾種。

豌豆發(fā)酵液是一種安全無毒、高效的天然抗褐變物質(zhì)，本試驗為進(jìn)一步鑒定豌豆發(fā)酵液中抗褐變成分提供了重要參考。

參考文獻(xiàn)

[1]劉金豹，翟衡，張靜.果汁褐變及其影響因素研究進(jìn)展[J].飲料工業(yè)，2004，7(3):1－5

[2]黃浩.馬鈴薯多酚氧化酶性質(zhì)及抑制劑作用機理的研究[D].廈門:廈門大學(xué)，2006

[3]李全宏，趙雅松，蔡同一，等.鮮切馬鈴薯褐變抑制效果研究[J].食品科學(xué)，2005，26(9):92－95

[4]Kim J，Uyama，H.Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources:Structure，inhibition mechanism and perspective for the future[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2005，62:1707－1723

[5]Parvez S，Kang M，Chung H S，et al.Naturally occurring tyrosinase inhibitors:mechanism and applications in skin health，cosmetics and agriculture industries[J].Phytotherapy Research，2007，21:805－816

[6]Kim，M J，Kim C Y，Park I.Prevention of enzymatic browning of pear by onion extract[J].Food Chemistry，2005，89:181－184

[7]Zocca F，Lomolino G，Lante，A.Dog rose and pomegranate extracts as agents to control enzymatic browning[J].Food Research International，2011，44:957－963

[8]馬玉榮.鮮切馬鈴薯褐變控制技術(shù)研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010

[9]徐涵，周麗，華漢威，等.豆類發(fā)酵液抑制馬鈴薯漿液褐變的研究[J].中國糧油學(xué)報，2012，27(9):35－39

[10]Sun J，Jiang Y M，Wei X Y，et al.Identification of epicatechin as the direct substrate for polyphenol oxidase isolated from litchi pericarp[J].Food Research International，2006，39，864－870

[11]Lee M K Park I.Inhibition of potato polyphenol oxidase by Maillard reaction products[J].Food Chemistry，2005，91:57－61

[12]吳壽金，趙泰，秦永祺，等.現(xiàn)代中草藥成分化學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2002:20－42

[13]王燕.喀什小檗果實化學(xué)成分定性分析[J].塔里木大學(xué)學(xué)報，2009，29(1):19－22

[14]Lin M Y，Yen CL.Antioxidative ability of lactic acid bacteria[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry 1999，47:1460－1466

[15]宋吉軒，陳超，雷尊國，等.馬鈴薯加工過程中褐變機理及其抑制效果研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(1):329－331.