趙 梅 韓忠杰 孫慶杰

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109）

玉米胚芽是玉米淀粉加工的副產(chǎn)品，在國內(nèi)來源比較豐富，含有較高的脂肪及蛋白質(zhì)，目前一般用于生產(chǎn)玉米胚芽油［1］。玉米胚芽粕是玉米胚芽提取玉米油后的殘渣，是玉米油廠的主要副產(chǎn)品，是一種玉米纖維和蛋白質(zhì)為主的高營養(yǎng)物質(zhì)［2］，其中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為23%～25%［3］，含有人體必需的8種氨基酸，其生物效價PER值與WHO／FAO推薦值相近，并且具有吸油、持水、乳化等功能性質(zhì)［4］，能被廣泛地應(yīng)用于肉制品、糕點及飲料等食品工業(yè)中。但一系列試驗表明，玉米胚芽蛋白很難兼顧幾種功能特性，或是很難達(dá)到某幾種特定功能性質(zhì)的平衡。因此，為了使玉米胚芽蛋白得到更好的應(yīng)用，必須改善其功能性質(zhì)［5］。

蛋白質(zhì)改性就是人為地對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行修飾從而改善產(chǎn)品在制造、加工和保藏過程中的物理化學(xué)性質(zhì)。目前對蛋白質(zhì)進行改性主要有化學(xué)改性、物理改性、生物酶改性、基因工程改性和復(fù)合改性等［6］。酶法改性蛋白質(zhì)不會導(dǎo)致營養(yǎng)素的損失，也不會產(chǎn)生毒理學(xué)方面的問題。而且蛋白質(zhì)的酶法改性還具有反應(yīng)時間短，專一性強，酶解程度可控制，在溫和條件下即可產(chǎn)生顯著效果等優(yōu)點［7］。張春紅等［8］發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以改善大豆?jié)饪s蛋白的持水性和吸油性。黃衛(wèi)寧等［9］認(rèn)為添加TG改變了燕麥面團的熱力學(xué)性質(zhì)。班進福等［10］研究發(fā)現(xiàn)MTG對餃子粉品質(zhì)有明顯的改善作用，Sun等［11］研究了TG酶對肌纖維和豆分離蛋白共混物的凝膠性質(zhì)的影響。但是孫煥等［12］研究TG酶改性大豆分離蛋白改性后發(fā)現(xiàn)盡管大豆分離蛋白凝膠性質(zhì)增加了，但是溶解度降低了，起泡性和泡沫穩(wěn)定性沒有出現(xiàn)太大影響，持水力也只達(dá)到了3．47。賀江航等［13］用TG酶改性魚肉蛋白凝膠硬度只能從4 N提高到14 N。盡管這些蛋白經(jīng)過TG酶改性某個性質(zhì)改善了，但是很難兼顧幾種功能特性的提高。本試驗著重研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTG）改性玉米胚芽蛋白粉的最佳條件，如加酶量、改性時間等對玉米胚芽分離蛋白的凝膠性質(zhì)的影響。此外，還探討了改性前后玉米胚芽蛋白粉其他功能性質(zhì)的改善，為進一步研究玉米胚芽蛋白產(chǎn)品提供了一定的參考。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

玉米胚芽：臨沂魯洲集團；微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTG，酶活力 100 U／g）：德國 AB酶制劑公司；6號溶劑、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸等均為分析純。

1．2 主要儀器

TA．XT Plus物性測試儀：英國Stable Micro Systems公司；BS224S型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PHS－3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；LXJ－ⅡB離心機：上海安亭儀器廠；C－18F電磁爐：廣東銀港科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋：龍口市先科儀器公司；BCD－257SL型冰箱：中國海爾集團；DHG－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1．3 方法

1．3．1 玉米胚芽蛋白粉的制取

取破碎玉米胚芽，按料液比1∶3加入6號溶劑，在40℃水浴下連續(xù)浸提6 h后進行抽濾脫脂，反復(fù)浸提、抽濾6次以上。將所得固體放于40℃烘箱進行烘干。將烘干后的樣品用高速萬能粉碎機粉碎，過100目篩，即可得到試驗所用玉米胚芽粉。

α－淀粉酶酶解：準(zhǔn)確稱取一定量的玉米胚芽粉放于燒杯中，按液料比10∶1加入pH 5．2的磷酸鹽緩沖液，沸水浴30 min，之后冷卻至37℃。按照酶添加量3 000 U／g加入α－淀粉酶，37℃下反應(yīng)3 h，離心干燥備用。

酸法提?。簻?zhǔn)確稱取一定量酶解后的胚芽粉，按料液比1∶9加蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，滴? mol／L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至 pH 4．6。在37℃、攪拌速度為3 000 r／min下反應(yīng)60 min，取出后離心取沉淀。重復(fù)上述步驟調(diào)節(jié)pH4．6進行酸沉，共重復(fù)3次。離心后的固體加入蒸餾水離心洗滌2次，經(jīng)冷凍干燥即可得到玉米胚芽蛋白粉，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大約為40%。

1．3．2 改性玉米胚芽蛋白粉的制備方法

MTG改性玉米胚芽蛋白粉的流程：玉米胚芽蛋白粉加MTG→加pH 8的磷酸緩沖液→水?。?5℃）→離心（3 000 r／min，15 min）→40℃鼓風(fēng)干燥→粉碎備用

1．3．3 MTG改性玉米胚芽蛋白粉的單因素試驗

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)：在改性時間2 h，加酶量10 U／g的條件下，研究底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%、8%、12%、16%、20%對玉米胚芽蛋白粉硬度的影響。

改性時間：在控制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，加酶量為10 U／g的條件下，研究改性時間為 1、2、3、4、5 h對玉米胚芽蛋白粉硬度的影響。

加酶量：在控制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，改性時間為2 h的條件下，研究加酶量為 0、10、20、30、40 U／g對玉米胚芽蛋白粉硬度的影響。

1．3．4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、改性時間、加酶量為試驗因素，酶改性玉米胚芽蛋白粉硬度為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。采用Design Expert7．1統(tǒng)計軟件，進行Box－Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析試驗。試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面影響因素及水平

1．3．5 MTG改性玉米胚芽蛋白凝膠硬度測定

參照文獻(xiàn)［14］用質(zhì)構(gòu)儀進行測定。

1．3．6 MTG改性玉米胚芽蛋白功能性質(zhì)的測定

持水力測定：稱取0．5 g改性后玉米胚芽蛋白粉，溶于9．5 mL蒸餾水中，用玻璃棒攪拌均勻，置于室溫下30 min，分散液以3 000 r／min離心10 min，稱量下沉物質(zhì)量m（g），持水力（Water Binding Capability）用下式計算：

WBC＝m／0．5

溶解性測定：將0．25 g玉米胚芽蛋白粉溶于10 mL蒸餾水中，攪拌1 h，分散液以3 000 r／min離心10 min，用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)的溶解度定義為上清液中的蛋白質(zhì)含量占該溶液中蛋白質(zhì)總量的百分?jǐn)?shù)。

吸油性測定：準(zhǔn)確稱取改性后樣品0．5 g置于10 mL離心管中，加入5 g玉米胚芽油，用玻璃棒攪拌均勻，放置30 min，用3 000 r／min的速度離心30 min，稱量下沉蛋白的質(zhì)量m。吸油性（Fat Binding Capacity）的計算公式為：

FBC＝m／0．5×100%

乳化性及乳化穩(wěn)定性：測定參照Pearce等［15］的方法，用pH 8的磷酸緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．6%的蛋白質(zhì)懸浮液，取24 mL蛋白質(zhì)溶液加入8 mL大豆色拉油，用剪切乳化儀在10 000 r／min下高速均質(zhì)l min制成乳狀液，立即用移液管從底部取1 mL乳狀液，稀釋于 9 mL 0．1%SDS溶液中，以 0．1%SDS溶液作對照，立即用分光光度計在500 nm處測定吸光值（A0）；放置20 min后，再次取樣測定。乳化活力（EA）以剛開始的吸光值A(chǔ)0表示，乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）用下式計算：

ESI＝A0×Δt／ΔA

式中：A0為初始乳化液的吸光值；Δt為20 min：ΔA為20 min后的吸光度與A0之差。

起泡性及起泡穩(wěn)定性：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的改性玉米胚芽蛋白溶液，取出100 mL在高速組織搗碎機中攪打（10 000 r／min）2 min，迅速倒入 200 mL量筒中，記錄泡沫體積V1，靜置10 min后再次測量泡沫體積V2，起泡性和起泡穩(wěn)定性計算公式如下：

起泡性 ＝V1／100×100%

泡沫穩(wěn)定性＝V2／V1×100%

1．4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert7．1統(tǒng)計軟件及Excell程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素對酶改性玉米胚芽蛋白粉凝膠硬度的影響

2．1．1 加酶量的影響

由圖1可以看出，隨著加酶量的增加，凝膠硬度隨之增大，當(dāng)加酶量達(dá)到20 U／g后，隨著酶添加量的增加凝膠硬度降低。這是因為當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，加酶量會存在一個臨界值［16］。酶添加量過少，酶不足以結(jié)合所有的底物，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成不完全，所以凝膠硬度較低。但加酶量過高會破壞體系中的動態(tài)平衡，對底物－酶作用體系產(chǎn)生影響［17］，導(dǎo)致出現(xiàn)加酶量增多，但凝膠硬度降低的結(jié)果。

圖1 加酶量對玉米胚芽蛋白粉凝膠硬度的影響

2．1．2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2可以看出，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凝膠硬度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時凝膠效果最佳，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時不成膠。這是由于當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)太小時，在一定時間內(nèi)蛋白質(zhì)底物接觸幾率降低，凝膠形成不完全。蛋白質(zhì)凝膠的形成機制一般認(rèn)為是蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)－溶劑的相互作用以及鄰近肽鏈之間的吸引力和排斥力平衡的結(jié)果，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時，蛋白質(zhì)－溶劑相互作用占優(yōu)勢，體系不易凝結(jié)成凝膠。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度后，體系有效水濃度降低，使得底物蛋白分子和酶分子的碰撞幾率降低，從而反應(yīng)速度降低，使得凝膠形成效率大大降低，凝膠硬度隨之降低。

圖2 底物濃度對玉米胚芽蛋白粉凝膠硬度的影響

2．1．3 改性時間的影響

由圖3可以看出玉米胚芽蛋白凝膠硬度隨著改性時間的增加先增加再降低，當(dāng)改性時間為3 h時，凝膠硬度達(dá)到最大值。這是由于隨著酶作用時間的延長，酶與蛋白質(zhì)底物不斷反應(yīng)，形成的交聯(lián)產(chǎn)物不斷增多，從而提高凝膠硬度。但是改性時間繼續(xù)增加，凝膠硬度呈下降趨勢，可能是由于過長時間的熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)中疏水基團變化、H鍵以及非共價鍵的斷裂有關(guān)［18］。

圖3 改性時間對玉米胚芽蛋白粉凝膠硬度的影響

2．2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2．2．1 響應(yīng)面法的試驗結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

利用Design Expert7．1對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到硬度Y與自變量改性時間（X1）、底物濃度（X2）、加酶量（X3）的二次回歸編碼方程模型為：

Y＝95．25＋5．32X1＋1．61X2＋11．84X3－12．95X1X2＋3．99X1X3－0．011X2X3－20．36X12－14．54X22－15．12X32

由于二次回歸編碼方程模型的各個因素在響應(yīng)面設(shè)計中均經(jīng)過無量綱性編碼處理，且各因素間一次項、交互項與平方項的回歸系數(shù)均不相關(guān)，故可以根據(jù)編碼方程中各個回歸系數(shù)的絕對值大小直接比較各因素對響應(yīng)值的影響程度，依次為：加酶量（X3）＞改性時間（X1）＞底物濃度（X2）。

通過方差分析來驗證模型及各參數(shù)的顯著性見表3。

表3 回歸分析結(jié)果

由表3可知失擬項P值為0．053 4，大于0．05表明失擬項不顯著，模型P值為0．025，小于0．05表明模型顯著。同時模型中的參數(shù)X3，X12，X22，X32都是顯著的。模型相關(guān)系數(shù)R2＝0．87，表明模型擬合度較好，能較好地反映各因素與相應(yīng)值變化的關(guān)系。

由圖4～圖6可直觀地了解各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。

圖4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶改性時間對硬度的影響

圖5 加酶量和酶改性時間對硬度的影響

圖6 加酶量和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對硬度的影響

2．2．2 最優(yōu)條件的求證及驗證

通過軟件Design Expert得到優(yōu)化的酶改性玉米胚芽蛋白粉的工藝條件為改性時間3．18 h；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10．88%；加酶量 24．16 U／g，預(yù)測最佳凝膠硬度的理論值為98．165 g。對優(yōu)化條件進行驗證試驗，重復(fù)3次，凝膠的硬度可達(dá)到98．13 g，預(yù)測值與理論值基本一致。說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件可靠。

2．3 改性前后玉米胚芽蛋白功能性質(zhì)對比

玉米胚芽蛋白粉提取工藝采用的是酶解結(jié)合酸解，與楊麗等［19］采用纖維素酶提取玉米胚芽蛋白質(zhì)工藝流程相近，但是本試驗采用了不同的水解酶－淀粉酶，最后得到的玉米胚芽蛋白粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其纖維素酶法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)42．5%接近。本試驗做了大量重復(fù)試驗和放大試驗結(jié)果蛋白質(zhì)含量變化不大，所以可以作為試驗材料。

在最佳改性條下，即加酶量 24．16 U／g；反應(yīng)時間190 min；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%，得到的改性玉米胚芽蛋白粉與未改性玉米胚芽蛋白粉的功能性質(zhì)見表4。

表4 改性對玉米胚芽蛋白粉功能性質(zhì)的影響

由表4可知經(jīng)改性處理后持水力增加了35．39%，這是由于以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ一羧酰胺基作為?；w，蛋白質(zhì)或肽鍵上賴氨酸殘基的ε－氨基、游離氨基酸的ε－氨基作為酰基受體，它們在一定條件下形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε－（γ－谷氨酰）賴氨酸異肽鍵［20］，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，形成分子內(nèi)及分子間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而截留住更多的水分。

改性后的玉米胚芽蛋白粉溶解性提高幅度不大，改善效果不明顯，約為5%。然而Babiker等［21］用TG對大豆分離蛋白改性試驗結(jié)果表明，經(jīng)TG改性后的蛋白質(zhì)溶解性得到明顯改善。這可能是由于MTG改性所導(dǎo)致的溶解性變化是有兩方面共同作用的結(jié)果：一方面是蛋白質(zhì)分子交聯(lián)使分子量增大，從而溶解度下降；另一方面是TG的脫氨作用，使谷氨酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，離子化基團增多，溶解性增加［22］。

改性后吸油性較未變性蛋白提高了56．94%。這一方面是由于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠吸附更多的油，另一方面是由于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有阻止油脂遷移的能力。

改性后玉米胚芽蛋白粉乳化能力沒有明顯改善，而乳化穩(wěn)定性提高了13．31%。主要是由于MTG酶的作用，在蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)引入了大量的氫鍵，使蛋白質(zhì)形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)－水的作用增加，體系的黏度增加，使乳化體系更加穩(wěn)定。也有可能是改性蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)的部分疏水性殘基暴露在外，界面張力變小，因此乳狀液體系變的更加穩(wěn)定。乳化能力與蛋白質(zhì)的溶解性呈正相關(guān)，當(dāng)溶解度提高，它在水－油界面擴散速度和吸附的能力大大提高，使得蛋白質(zhì)疏水性殘基快速向油相排列，形成相應(yīng)的界面性質(zhì)［8］。而MTG酶的作用沒有改善溶解度，所以乳化能力的提高也很有限。

MTG酶改性后的玉米胚芽蛋白粉起泡能力沒有明顯改善，而泡沫穩(wěn)定性提高10．8%。蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力與泡沫的穩(wěn)定性一般是相反地，起泡能力是由蛋白質(zhì)分子的快速擴散、疏水基團的暴露等因素決定，泡沫穩(wěn)定性取決于溶液的流變學(xué)性質(zhì)，主要有蛋白質(zhì)的水合、分子間相互作用。由于改性后的蛋白質(zhì)間或內(nèi)相互作用增加，溶液黏度提高，使得形成的氣泡穩(wěn)定性提高。

3 結(jié)論

3．1 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了玉米胚芽蛋白粉酶改性處理的條件。得到酶改性的最佳工藝條件為改性時間3．18 h；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10．88%；加酶量24．16 U／g，在此工藝條件下得到的凝膠硬度為98．13 g。

3．2 MTG酶改性處理對于玉米胚芽蛋白粉持水力、吸油性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性明顯提高，而對溶解度、乳化性和起泡性改善的不明顯。

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